马晓丽 2014生态学硕士 21140611116
摘要：海洋微微型浮游生物是指径粒大小介于0.22μm和2微米之间的浮游生物，在世界各海域广泛存在，包括微微型浮游植物和微微型浮游动物。它们是海洋生态系统的重要组成部分，在维持海洋生物系统稳定，促进物质循环和能量流动上起重要作用。研究微微型浮游生物在不同时间、不同海域的丰度和多样性可以探索其分布规律和生态学作用，为环境评价、预测等提供数据参考和理论依据。为此，本文综述了目前世界范围内微微型浮游生物丰度和多样性的研究方法以及我国在该领域的研究状况。
关键词： 微微型浮游生物；生态系统；丰度和多样性；研究方法
Abstract: Picoplankton（varying from 0.2 to 2μm） including picophytoplankton and picozooplankton are widely distributed in the oceans all over the world. They are important portions of plankton and play an crucial role in the maintaining of stability of ecosystem in the ocean and the material recycling and energy flow. Studying of the abundance and diver
sity of picoplankton in different locations and time will help in the understanding of the rules of the distribution and the ecological status of picoplankton. And the knowledge of abundance and diversity of picoplankton will help to make a solid foundation for studying the impact of human activities on biological diversity and provide reference data and theoretical foundation for environmental assessment and forecast. Therefore, the research methods of the abundance and diversity of picoplankton and domestic research situation in the field were reviewed in this paper.
Keywords: picoplankton; ecosystem; abundance and diversity; methods of research
引言: 海洋微微型浮游生物指的是海洋中存在的粒径小于2微米的浮游生物,主要包括聚球藻、原绿球藻、微微型真核浮游生物异养细菌等类。随着微食物环概念(Microbialloop)的提出,微微型浮游生物在海洋生态系统中的作用越来越受到人们的重视【1】。对于它们在海洋中的生态分布变化及影响因素的研究也日益受到研究者的关注。海洋微微型浮游生物在全球海洋中是生物量和生产力的重要贡献者,是生命和非生命系统联系的关键环节,是生源要素循环的重要驱动力
【2】无线通信系统。微微型浮游生物中的光合自养生物,在全球各大洋和近岸海域都有分布,对海洋初级生产及海洋碳循环有巨大的贡献,是微食物网重要的组成部分【3】。异养细菌在海洋中既是分解者,又是生产者,它们利用水体中的溶解有机物(DOM)转化为自身物质以生长和繁殖从而形成颗粒有机物(POM),随着原生动物摄食异养细菌,这部分POM被再次传递返回经典食物链中,使海洋中大量的溶解有机物得以迅速循环再利用,大大提高了初级生产提供的物质与能量的利用效率浮游病毒作为分解者对微食物网中各主要角都有相当程度的影响,病毒对细菌和藻类的裂解向水中释放DOM,这部分DOM又被细菌再利用,产生了微食物环的病毒回路(Viral Shunt),影响了海洋海洋生态系统物质循环和能量流动的途径[4]。
在国际上,对海洋微微型浮游生物的研究在上世纪客户端开发70年代,随着显微技术以及其他多种研究技术和手段的发展,开始逐渐兴起"我国的海洋微微型浮游生物生态学研究起步较晚,一方面是研究手段的限制【2】,另一方便是历史原因所导致,直到上世纪80年代后期才逐渐开展。近年来,对我国近海微微型浮游生物生态学的报道逐渐增多,取得了重要的进展,积累了许多宝贵资料。
图1：微微型和微型浮游生物的一种分类方法：
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1. 微微型浮游生物研究进展
在微微型浮游生物丰富研究上，由于早前研究对微微型生物未给予足够重视,对其形态结构、种类组成等知之甚少。1970年代起,研究者们开始运用荧光显微技术( FEM )、流式细胞术(FCM)【5】 及电子显微技术(EM)【6】 进行海洋微微型生物的丰度检测和形态观察。 微微型浮游生物按其食性，细胞核性质，细胞进化与结构等分类方法不一，这里分为微微型浮游植物和微微型浮游动物两类。其中的微微型浮游植物类主要有原绿球藻（Prochlorococcus，简称Pro）、聚球藻(Synechococcus，简称Syn)和微微型真核浮游植物（Picoeukaryote，简称Euk）3类。根据藻胆素组分的不同，又可将聚球藻分成富含藻红素的聚球藻（Phycoerythrin-rich, PE）和富含藻蓝素的聚球藻（Phycocyanin-rich,PC） 两类。聚球藻(0.6-1.6μm)对低温较不敏感，并且可以利用多种营养盐，在纬度较高，水深较浅的海域和河口中广泛分布【9】。原绿球藻细胞极小（0.54-0.67μm），含有独特的素二乙烯基叶绿素（divinyl-chlorophyll a,b），也是唯一利用该种素作主要光合素的野生型物种，分布在南北纬40°之间的大洋中，在寡营养热带、亚热带大洋海区等营养盐含量较低的海域是浮游植物的优势种【10】。微微型真核浮游植物泛指直径＜3超声波探测μm的所有真核浮游植物类，物种组成非常复杂，多样性丰富，分布比原绿球藻和聚球藻更为广泛【11】。由于微微型浮游动物与微微型真核浮游植物基本结构相似，有许多交集，目前国际上划分不是很明显，两者研究方法基本相同【12】。
在微微型生物多样性研究方面，20世纪70年代末,由于落射荧光显微镜技术的应用,科学家
们发现聚球藻在海洋中的普遍存在聚球藻是一类单细胞、个体微小(0.6-2μm)、球形或短棒状、进行二分裂的蓝细菌(cyanobacteria)。与真核藻类和高等植物相似,聚球藻以叶绿素a作为主要光合素进行放氧光合作用【7-9】。20世纪80年代，Chisholm等于1988年在对北大西洋和太平洋浮游植物进行研究时发现在真光层底部有一种细胞体积极小但数量极大，能够发弱红荧光的球状或棒状细胞，其细胞素为类似叶绿素a的素。通过纯化培养后Chisholm等人于1992 年将其命名为 Prochlorococcus marinus。【21】此后, Pro的研究引起了浮游生物研究者的极大兴趣, 并在短短数年内获取了关于其分布、动态生理和进化等等方面的大量资料。直至21世纪初,分子生物学的迅速发展才使得人们可以直接利用 DNA 序列分析开展微微型真核生物的分子多样性研究【13】。2001年,Moon-van de Staay等【14】 首次运用真核生物通用引物研究太平洋表层海水中微微型真核生物的分子多样性。目前,研究者们已利用分子生物学技术对太平洋【15】,地中海【16】,红海【17-18】,印度洋【19】,北冰洋【20】,南极附近水体【21】等世界各大海域进行了微微型浮游生物多样性研究,获得了大量微微型真核生物基因序列。
2. 微微型浮游生物丰度常用研究方法
2.1 培养技术法
即通过对细菌进行一定条件的培养,根据细菌的菌落数或生长状况计算细菌的数量。平板计数法是经典的细菌计数方法：将所要计数的细菌适度稀释,然后在特定的平板培养基上进行培养,通过计数生长出的单菌落数,来计算细菌的丰度。该方法的缺点较明显:需要严格无菌的操作环境,不适于现场试验;现有的培养基和培养条件并不适宜所有海洋细菌的生长,所以目前本方法在现场试验中较少使用。但是通过平板法可以获得活的单菌落,在对细菌的分离纯化、分类鉴定研究中还在使用。空斑法是计数病毒数量的经典方法,原理与平板计数法类似,将病毒稀释后与过量的宿主混合,然后铺种于平板培养基上,培养一定时间后细菌繁殖成乳白衬底,被病毒裂解的区域则在此衬底上表现为圆形的透明斑,称为噬斑"噬斑数代表该接种量中有活力的噬菌体数量。如果挑出单个噬斑来培养,可以获得由单个噬菌体所繁殖的后代,达到分离纯化的目的"空斑法依赖于病毒对宿主的感染,并不适宜自然水样总病毒的定量研究。
2.2 透射电子显微镜法(Transmission electron microseopy，TEM)
TEM法的基本原理为以电子激发的光子作为光源照射被观测样品,这种方法分辨率高,可以油砂
观察到细胞的亚显微结构【22】;可以观察到含有病毒颗粒的细胞;可以观察到病毒颗粒的形态,初步确定病毒的种类;烤肉炉子可以测量细胞的大小和体积,进而估算细胞碳含量。但TEM法样品制备方法复杂,成本高,仪器操作复杂且耗时,不适合在现场调查中使用。
2.3表面荧光显微镜法(Epifluorescence microseop，EPM)
EPM是较常规的实验室检测方法,主要原理是利用特异性荧光染料对样品进行染,通过在荧光显微镜下观察特异荧光来计数细胞数目。对于海洋微微型浮游生物的研究,由于聚球藻、原绿球藻和微微型真核浮游生物自身含有荧光基团(PE和叶绿素),不需染可直接在荧光显微镜下观察;异养细菌和浮游病毒由于不含素,需要染后进行观察。与TEM法相比,EPM法样品制备过程简单,仪器操作和样品观察简单,但在浮游病毒的计数中,个体较大的病毒和个体较小的细菌不易区分。
2.4 流式细胞仪法(Flow Cytometry,FCM)
流式细胞仪是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的科学技术设备,是生命科学研究领域中先进的仪器之一。通过流式细胞仪可以对处于快速直线流动状态中的单列
细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选。Olson等于1985年首次将FCM安装在科考船上进行样品的现场检测【23】。相对于前面介绍的几种方法,流式细胞仪在海洋微微型浮游生物研究方面有很大的优点,它可以自动、快速的对细胞进行多参数测量,获得细胞的荧光性质、散射光性质,以及样品细胞丰度等多种信息,近年来已被广泛应用于海洋生态调查中。但是,流式细胞仪也存在一定缺点,如仪器价格较昂贵，对仪器的操作需要丰富经验,每次检测样品之前都要对仪器进行校正。
3. 微微型浮游生物多样性常用分子技术研究方法
由于海洋微微型浮游生物种类繁多，个体微小，且常常不同种类间缺乏明显的形态区别，故难以用传统的方法来研究其系统发生关系和种类组成。直至21世纪，各种分子生物技术的应用，极大推动了微微型浮游生物多样性的研究。以下对目前国内外常用的研究微微型浮游生物多样性的分子生物学技术以及其优缺点进行了归纳总结。
3.1 构建克隆文库
构建克隆文库是研究微微型真核生物分子多样性的传统方法【24】。其优点为步骤简单,不
需要使用特殊仪器,并且避免了一些分子标记技术的技术限制。Takishita 等【25】运用构建克隆文库技术对海底淤泥样品进行了微微型真核生物多样性研究。Zuendorf 等【反光雨衣26】对丹麦玛丽艾厄海峡样品进行克隆文库的构建,对随机选取的 400 个克隆进行测序,最后获得 70 个属于不同种类微微型真核生物的OTUs。这些研究均获得了丰富的微微型真核生物多样性。这表明,克隆文库构建方法适合用于微微型真核生物分子多样性研究,利用该方法能够获得对环境样品中真核生物多样性的客观认识。但是,构建克隆文库直接测序耗时且花费较大,并且和其他基于DNA 分析分子多样性的技术一样,存在另一个弊端,即仅通过DNA序列分析无法区分获得的序列所代表的细胞是否真实存在,如对海底沉积物样品进行研究,时常获得实际并不生活在淤泥中的硅藻类,其死亡细胞由于沉降作用而存在与淤泥中。Stoeck 等设计了1个避免此类误差的方法,他们通过对同一环境样品同时构建rDNA 文库和 cDNA文库的方法区别死亡细胞和真实存在的细胞。这一技术给微微型真核生物分子多样性研究提供了新途径【27】。
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