LSPR生物传感技术的研究与应用
刘国华,孙辉, 张维，王程，王育剑，徐凯，岳钊
（1.南开大学 信息技术科学学院，天津 300071；）
摘要：基于局域表面等离子体共振（LSPR）现象的传感器是目前传感技术领域的一个研究热点。LSPR传感器在物理、化学特别是生物等学科的检测分析方面具有明显的技术优势。本文介绍了LSPR传感器的技术原理和特点，对目前研究的几种LSPR传感器结构和制作方法进行了比较，并且对LSPR传感技术的应用、未来发展趋势和商业化前景等进行了分析讨论。 关键词：局域表面等离子体共振（LSPR）；生物传感器；纳米颗粒
Research and Application on the LSPR Bio-sensing Technology
Liu Guohua ,Sun hui , Zhang Wei,Wang Cheng,Wang yu jian, Xu kai,Yue Zhao
(1.College of Information Technology and Science, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract: Recently, the research on the localized surface plasmon resonance (LSPR) sensors is one of the hot-spots in the filed of sensor technology. The LSPR sensors have obviously technology advantage in detecting and analyzing the properties of physics and chemistry, especially biology. This review introduces the technical principles and features of LSPR sensors and compares the current research of several LSPR sensor structures and production methods. Meanwhile, it discusses the future developments and commercial views of LSPR sensors.
Key Words: Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR); Biosensor; Nanoparticle
1．引言
近年来，纳米材料由于其独特的光学、电磁学和力学特性而得到了研究人员的广泛关注。贵金属纳米粒子显示了很强的紫外－可见光吸收带特性[1-8]。科学研究表明，贵金属纳米粒子的这种特有性质取决于它们和光的强烈作用。对贵金属纳米粒子光学性质的研究在理论和实践上都具有重要的意义。从理论上说，它对于系统研究纳米量级结构和引起光 学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等起到了十分重要的作用。从实践上说，如果纳米结构的光学性质可调试，则它可以应用于表面增强光谱[9-13]，光学滤波器[14,15]，等离子体设备[16-19]和传感器等领域。
LSPR（Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR）纳米传感器的传感机理与SPR（Surface Plasmon Resonance, SPR）传感器有一定的相似性，LSPR传感器可以看作是SPR传感器的拓展和延续。前者的表面等离子体共振发生在金属纳米颗粒局部，后者的共振发生在连续金属薄膜表面；然而，发生在纳米颗粒局部的共振表现出的光学特性与SPR不同，在传感领域具有很大的应用潜力，因此得到了广泛研究[20-26]。贵金属（如金、银）纳米粒子，在紫外－可见光区域表现出独特的光学响应[27, 28]，有强吸收作用。LSPR现象发生时，入射光子频率和金属纳米粒子或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配，对光子能量产生很强的吸收作用，而且吸收率随着光子能量的减少呈指数衰减，因此出现LSPR带。研究显示，LSPR吸收谱对粒子结构和周围环境媒介等很多因素都非常敏感[29-35]。被测溶液和固定探针分子的纳米颗粒之间的反应能够引起生物分子层厚度的变化，从而引起LSPR吸收峰的位移，因此基于LSPR的检测方法能够对这种即时变化进行动
态检测[36, 37]。以NSL（nanosphere lithography, NSL）技术制作的银纳米粒子为例，当增加被吸附物层的密度和厚度时，会产生连续波长的红移。纳米粒子表面分子的大小和密度决定波长的移动响应，表面结合的配体和溶液中的目标分子共同决定系统的检测能力，整个反应归因于分子间的特异性选择。LSPR纳米传感器的性能优化可通过调整所使用的纳米粒子的大小和形状实现[30, 38]。
纳米材料与生物高分子、蛋白质、核酸等在尺寸大小上具有相同的量级，所以在生物医学领域，基于金属纳米颗粒的LSPR传感器具有明显的技术优势。这种传感器可以广泛应用于药物研究、生物检测、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究及疾病诊断等方面[22, 39, 40]。
2．LSPR传感器原理
LSPR现象是发生在金属纳米结构中的传导电子共振现象[41-45]，常见的金属纳米结构包括纳米球，纳米三角形[46]，纳米岛[42]等。当光子跟金属纳米粒子中的传导电子振动相匹配时，就会产生LSPR现象。通过入射光电场激发产生LSPR，出现强光散射和强表面等离
子体吸收带，同时出现局部电磁场增强。纳米粒子在紫外光区域表现出唯一的光学响应[28]。表面等离子吸收带的频率、最大吸收波长和强度都高度取决于纳米粒子的化学成分、尺寸、分布、结构和周围的环境[29,30,34,47]。
当入射光子与金属纳米粒子中的自由电子的集体振动发生共振时，会产生LSPR现象。最简单的纳米粒子光学响应模型是Mie理论，它描述长波段球形金属颗粒的消光量。具体形式如下[35]电池钢壳：
其中，E(λl型匹配)为消光量，即吸收和散射光量的总和；NA是纳米粒子的局部密度；a是金属纳米球的半径；εm是金属纳米球周围介质的介电常数(假设为正实数，且与波长不相关)；λ是入射光波长，εi、εr分别表示金属纳米球介电常数的虚部和实部。当分母中的共振项(εr+2εm)2接近零时， 即达到了LSPR的共振条件。
从这个最原始的模型可以看出，金属纳米颗粒的LSPR光谱特性取决于以下几个方面：纳
米粒子的半径a、纳米粒子材料(εi和εr)以及纳米粒子周围介质的介电常数εm。进一步研究表明，在实际情况中，即纳米粒子不是球体时，吸收光谱还将取决于纳米粒子的几何线度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作
其中χ是形状因子项[11]，用来描述纳米粒子形貌比例。此外，LSPR还取决于粒子间距和表面绝缘常数等。由式(1)还可以看出，贵金属纳米粒子的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米粒子最大消光波长的移动响应能够被用于检测由纳米粒子周围分子引起的变化。
3．LSPR生物传感系统的基本结构
LSPR器件制作容易，它不像SPR器件那样需要特殊的系统结构，如衰减全反射光学或波导耦合器件，它可以利用NSL等技术达到很高的小型化程度。
一般来说，LSPR生物传感器系统包括光学系统，转换介质（光和化学/生物信号转换）和电子系统（具有光电器件并能进行数据处理）。转换介质把电荷转化为LSPR器件能识别的最大吸收波长和强度的变化。LSPR的光学系统包括一套光源并能产生表面等离子体波。在LSPR现象发生时，会产生一个电信号，并通过电子系统处理。LSPR传感器系统的性能主要取决于传感器子系统，传感器的敏感度和稳定度取决于光学系统和转换介质，传感器的选择性和响应时间主要取决于转换介质。以基于光纤的生物传感系统为例，LSPR生物传感系统主要包括激光器、斩波器、光纤耦合器、传感光纤、样液池、光接收器、锁相放大器和数据采集器等器件 [48]，如图1所示。LSPR生物传感器系统具有结构简单，操作方便，成本低廉等优点。
4．LSPR传感器制作及工艺
验光组合台 LSPR传感器制作的关键是金属纳米结构的制作，金属纳米结构主要包括纳米线阵，纳米粒子，纳米岛等，下面我们详细介绍这三种金属纳米结构的LSPR传感器的制作过程及工艺。
4.1 金纳米线阵表面结合自组装分子
在硅基板上旋涂浓度为1.25%的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶液，膜厚约50nm，在150°C下烘烤半小时，去除水气并使PMMA排列定型。使用原子力显微镜（Smena-HV, NT-MDT, Russia）进行纳米压印，力学常数为钻孔电视40N/m，探针针尖直径约20nm（NSC15, MikroMasch, Russia）。这个过程主要是在铺有PMMA的硅基板上刻划出纳米凹槽后，用电子蒸镀系统。蒸镀时，要先蒸镀厚度约为1nm的钛层，再蒸镀厚度为20nm的金层。制作中还要辅助剥离与清洗过程。最后，可以得到线宽小于100nm金纳米线阵列，流程图如图2所示。
在室温下，把制作好的金纳米线阵列芯片浸入浓度为10-3M的十八烷硫醇（ODT）酒精溶液中，经过一段特定时间后取出芯片，立即用酒精清洗并用氮风干。最后，在空气中用加热板在100°C下烘烤约10分钟，确保残留在芯片上的水分完全去除，进而可以得到表
面结合了ODT分子的金纳米线阵列[49]。
4.2 利用NSL技术制作Ag纳米微粒
纳米球光刻（NSL）技术是一种纳米加工制造技术，利用这种技术能够控制表面纳米微粒的形状、尺寸和结构。在实验研究中，利用这种技术合成面宽约为美容按摩器100nm，高为500nm的Ag纳米三角形微粒，并采用LSPR光谱测量法测量微粒的光学特性。
为制备LSPR生物纳米传感器，需要用自组装单层膜使Ag纳米三角形微粒具备吸附功能，然后利用零长度耦合试剂将生物素共价连接到羧基上。
如图3所示，Ag纳米微粒的制作步骤如下：（1）清洁基片；（2）将单一溶剂聚苯乙烯纳米球滴落覆盖在基片上；（3）烘干六边紧密填充的纳米球单层膜，形成纳米球掩模；（4）Ag蒸发沉积在样品上；（5）在乙醇中进行超声波降解去除纳米球掩模；（6）制备出Ag纳米微粒样品[50]。
4.3 金纳米岛芯片的制作
在金纳米岛芯片上旋涂SU-8 100（Microchem, USA）（先在500rpm下持续5秒，后在1500rpm下持续30秒），涂层厚度为200μm，然后在95°C下前烘100分钟。在波长为365nm处进行紫外曝光（每次能量密度为630mJ/cm2），可以形成一个8×8的井（Φ=800μm）阵列图案。在曝光后，在95°C下进行30分钟后烘，然后将其置于SU-8显影液中，进行3分钟弱超声波处理，去除井区域不交联的SU-8树脂并使部分井中的金纳米岛表面曝光。
向金纳米岛芯片表面的井中放入0.2μL不同含量GST-hIL6防水按键细胞裂解液，将芯片在25°C下放置在密闭的培养皿中，以防止样品溶液蒸发，然后将芯片用磷酸盐缓冲溶液（PBS）和去离子水彻底冲洗，并用氮气风干[51]。
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