聚乙烯亚胺对肝细胞系Chang liver、肾细胞系MDCK亚细 高小玲1 姚磊1 陈红专
（上海交通大学医学院药理教研室，上海，200025）
摘要：目的研究阳离子型聚合物聚乙烯亚胺（PEI）对正常肝细胞系Chang liver、正常肾细胞系MDCK的细胞毒性，特别是对细胞膜、线粒体、溶酶体、细胞核等亚细胞结构的毒性效应及其毒性机制。方法采用高内涵分析、流式细胞分析、激光共聚焦成像分析和Wesrern Blot等技术。结果高内涵分析显示PEI可浓度依赖性地引起细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、溶酶体酸性环境破坏、细胞核固缩等毒性效应，其中细胞膜通透性、溶酶体毒性为可逆性变化，线粒体膜电位下降在恢复24 h后反而更明显；流式细胞分析显示凋亡并非PEI引起的急性细胞毒性的主要机制；激光共聚焦显微镜成像分析和Western Blot实验发现PEI 能明显诱导细胞自噬。结论 PEI可引起细胞膜细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、溶酶体酸性环境破坏、细胞核固缩等多种亚细胞毒性；PEI可诱导细胞自噬，这可能与其细胞毒性密切相关。该研究在一定程度上深化了阳离子型聚合物细胞毒性机制研究，揭示了PEI引起细胞毒性的新机制，为该类载体的安全性评价提供了新视角。 关键词：细胞毒性；自噬；细胞核；细胞膜；线粒体；溶酶体
中图分类号：R186 文献标识码：A
阳离子型聚合物由带正电荷的高分子聚合物构成，可通过静电相互作用与DNA形成纳米级复合物，被广泛用于基因药物递送，是目前唯一获得较高体内基因递送效果的非病毒基因载体。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）是常用的阳离子型聚合物之一，这类聚合物载体在基因和某些化学药物的递送上显示了
其他载体难以比拟的优势，但其临床应用却存在一大障碍——细胞毒性较大[1-3]。肝、肾分别是体内最重要的代谢和排泄器官，也是阳离子型聚合物体内主要分布器官[4-6]，因此肝、肾毒性可能成为其体内应用的主要障碍。现有的PEI细胞毒性评价往往采用反映细胞某方面功能的单一指标，缺乏对亚细胞结构与功能全面、综合的分析，极大限制了该类载体细胞毒性机制的阐明和安全性载体的设计。本研究采用细胞组学的方法，通过高内涵分析、流式细胞分析、激光共聚焦成像分析和Wesrern Blot等技术研究了PEI对正常肝细胞系Chang liver、正常肾细胞系MDCK的细胞毒性，特别是对细胞膜、线粒体、溶酶体、细胞核等亚细胞结构的毒性效应，旨在进一步揭示PEI的细胞毒性机制，为该类载体的安全性评价提供了新视角，也为安全性载体的设计和评价提供有价值的参考。
1材料与仪器
1.1细胞系：肝细胞系changliver；肾细胞系MDCK
1.2主要药品与试剂：聚乙烯亚胺（PEI）（Branched, 25 K, Sigma）；高糖DMEM （Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，HyClone）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS, GIBCO）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO）；青霉素–链霉素(penicillin/streptomycin, GIBCO)；非必需氨基酸（GIBCO）；L-谷氨酰胺（GIBCO）；十二烷基硫酸钠（SDS）(Sigma)；电泳级四甲基乙二胺（TEMED）（Merck）；PVDF膜（Millipore）。
1.3主要仪器：二氧化碳培养箱（THERMO）；高内涵筛选分析仪（THERMO）；激光共聚焦显微镜（LSCM510，ZEISS）；流式细胞仪（FACSCalibur，BECTON DICKINSON）；蛋白电泳槽（BIO-RAD）。
桥梁建设2实验方法
2.1细胞培养
细胞培养液（90% DMEM，10% FBS，1% 青霉素–链霉素，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺溶液），5% CO2 ，37℃培养。
2.2 高内涵分析
MDCK、Changliver生长至80%到90%汇合度，以5×104个/ml，每孔100 µl
工业盐水
接种到96孔板，培养24 h。MDCK空白组（三个复孔）每孔加50 µL DMEM，PEI处理组（三个复孔）分别加入50 µl浓度为5、10、14、18、22、26、30、40、60 µg/ml的PEI溶液；changliver空白组（三个复孔）每孔加50 µL DMEM，PEI 处理组（三个复孔）分别加入50 µl浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10、20 µg/ml 的PEI溶液。37℃孵育3 h后，高内涵多毒性试剂盒（Thermo）染，高内涵分析检测不同浓度PEI对MDCK和Changliver不同亚细胞结构的毒性效应。为研究PEI引起的亚细胞毒性效应是否可逆，PEI作用3 h后，换完全培养基，继续培养24 h，同法进行多毒性试剂盒（Thermo）染，高内涵分析。烟雾过滤器
2.3 流式细胞分析
MDCK、Changliver生长至80%到90%汇合度，以1×105/孔的密度接种到六孔板，培养24 h。空白组与PEI处理组，分别加入DMEM与PEI溶液37℃孵育。作用3 h后PBS缓冲溶液漂洗两次，无EDTA胰酶消化，完全培养液中和，1500转/分钟离心5分钟，弃去上清，每管加入60µl binding buffer分散细胞，Annexin V/PI凋亡试剂盒（BestBio）染，流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死情况。
2.4 激光共聚焦显微镜成像分析
MDCK、Changliver生长至80%到90%汇合度，以细胞密度1×105/孔，3 ml 种到直径35mm的玻底皿（玻底孔径20mm）中，培养24 h。MDCK空白组与PEI处理组，分别加入DMEM与和浓度分别为20、
40µg/ml的PEI溶液；Changliver 空白组与PEI处理组，分别加入DMEM与和浓度分别为4、8µg/ml的PEI溶液。37℃孵育3 h后按以下方法处理：吸弃培养液，PBS漂洗2次。加预热至37℃的3.7%的甲醛溶液，室温固定15分钟。吸弃固定液，PBS漂洗3次，加入封闭液（将山羊血清用0.3%PBS/Triton稀释成5%），室温封闭1 h。吸弃封闭液，加入用0.3%PBS/Triton 1:200稀释LC3抗体，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次，加入用0.3%PBS/Triton 1:300稀释的FITC标记羊抗兔IgG，室温孵育1.5 h，PBS漂洗3次。加300nM的DAPI核染料室温避光染10 min，LSCM510检测观察自噬小体形成。
2.5 Western Blot检测自噬相关蛋白表达
对数生长期的MDCK、Chang liver以1.2 × 106个/皿接种于10cm培养皿，培养24 h。MDCK空白组与PEI处理组，分别加入DMEM与和浓度分别为20、
40、80µg/ml的PEI溶液；changliver空白组与PEI处理组，分别加入DMEM与和浓度分别为2、4、8µg/ml的PEI溶液。孵育3 h后，将细胞平板取出置于冰上，吸弃培养液，用预冷PBS漂洗两次，加入100 μl预冷细胞裂解液，充分分散，用细胞刮刀刮下收集细胞，冰浴裂解30分钟，分装保存于-20℃待用。蛋白裂解液煮沸变性10 min，30-40 μl上样，12 % SDS-PAGE电泳分离（60 V，40 min 后120 V，1 h）。分离后的蛋白通过湿转（200 mA，50 min）转移到PVDF膜。而后将PVDF膜置于杂交盒中，加入足量封闭液（5% milk-TBST），室温孵育2 h封闭。弃封闭液，加足量1% milk-TBST/ TBST
振荡洗涤5 min。加入用1% milk-TBST 1:1000稀释的LC3一抗稀释液，室温孵育1 h，4 ℃孵育过夜。移弃一抗孵育液，用足量洗液振荡洗涤5 × 5 min。加入用1% milk-TBST 1:8000稀释的HRP标记二抗稀释液，室温振荡孵育1 h。移去二抗孵育液，用足量洗液振荡洗涤5 × 5 min。将Supersignal west pico chemiluminescent substrate试剂盒中的A 液与B液以1:1混匀，按0.125 ml/cm2滴到PVDF膜的蛋白面，室温避光孵育5 min，自动洗片机洗片。
3结果
3.1高内涵分析
高内涵分析显示PEI可浓度依赖性地引起Changliver、MDCK细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、溶酶体酸性环境破坏、细胞核固缩（图1）。PEI作用3 h后显著引起上述亚细胞毒性效应。换完全培养基，继续培养24 h，发现细胞膜通透性明显降低、溶酶体毒性减小；但是细胞核固缩、线粒体膜电位下降现象无明显改善，反而有所增强。半数毒性浓度结果显示Changliver对PEI引起的毒性效应更敏感（表1）。PEI引起的线粒体膜电位下降在恢复24 h后反而更明显。
图 1. PEI 作用3 h （3 h ）或作用3 h ，恢复24 h （24 h ）引起MDCK （A ）、Changliver
办公椅扶手（B ）亚细胞结构毒性效应（细胞核固缩、细胞膜通透性增加、溶酶体酸性环境破坏、线粒体膜电位下降）的量效曲线图。软件自动化测试技术
表1．PEI 引起Changliver 、MDCK 不同亚细胞结构毒性效应的半数毒性浓度（μg/ml ）
3.2流式细胞分析
流式细胞分析显示，在实验浓度PEI 作用3 h 后，两种细胞早期调亡百分率均不超过5 %，提示调亡可能不是PEI 急性毒性的主要机制（表2、3）。
表 2. Changliver 细胞经不同浓度PEI 作用3 h 后调亡试剂盒染，流式细胞分析
调亡和坏死情况洗衣机水嘴
changliver 细胞核大小细胞膜通透性溶酶体破坏线粒体膜电位
3 h 4.68 4.20 5.10 8.5
4 3 h ，24 h 恢复
6.59 4.16 4.21 2.25 MDCK 细胞核大小细胞膜通透性溶酶体破坏线粒体膜电位
3 h 11.68 10.03 16.56 28.15 3 h ，2
4 h 恢复
21.68 13.68 22.31 14.57 PEI 浓度 (µg/ml)
00.51 2 4 6 8 10早期调亡百分率（%） 1.53 1.80.99
2.15 2.38 4.48 4.21 2.69
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