2023年2月SURFACE TECHNOLOGY·343·
表面功能化
TPS浓度对生物相容性的影响
郝港桐，陈俊英，李莉，张鼎，翁亚军
（西南交通大学 材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031） 摘要：目的在钛表面构建BVLD/TPS修饰层，并研究TPS浓度对其表面生物相容性的影响，从而筛选出最优TPS浓度。方法将树枝状分子（PAMAM）接到钛表面，借助其端部氨基基团，将抗凝分子BVLD、促内皮功能分子TPSLEQRTVYAK肽（TPS）引入，构建出PAMAM-BVLD/TPS修饰层，重点研究TPS浓度对构建层生物相容性的影响。采用扫描电镜（SEM）、免疫荧光染、傅里叶变换红外吸收光谱仪（FT-IR）、水接触角测量等对修饰层形貌、结构、表面亲疏水性等进行表征；使用酸性橙、Micro-BCA对Ti表面修饰层的活性基团进行测试。采用血小板粘附与激活试验、活化部分凝血活酶时间（APTT）评 价血液组分与修饰层之间的相互作用。采用半体内循环试验评价修饰层与全血的相互作用。结果成功构建修饰层，修饰层表面血小板粘附数量和激活程度均明显降低，其中TPS浓度为3 mol/L时，激活程度较低。APTT时间显著延长，其中修饰层APTT为37 s左右，相比对照组延长10 s左右。细胞相容性评价结果表明，与Ti表面相比，修饰层表面ECs粘附数量和增殖活性均增加，其中TPS浓度为3、5 mol/L时，内皮细胞生长情况最好，半体内循环试验结果表明，修饰层能够显著抑制血栓的形成。结论在钛表面成功构建了BVLD/TPS修饰层，并初步探索出TPS的最优浓度，即当TPS浓度为3 mol/L时，其血液相容性以及细胞学评价良好，可以用于钛表面生物修饰层的研发与应用。
关键词：表面改性；比伐卢定；促内皮；抗凝；细胞相容性
中图分类号：TG146.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3660(2023)02-0343-09
DOI：10.16490/jki.issn.1001-3660.2023.02.032
Construction of PAMAM-BVLD/TPS Modification Layer on Titanium Surface and Effect of TPS Concentration on Biocompatibility
HAO Gang-tong, CHEN Jun-ying, LI Li, ZHANG Ding, WENG Ya-jun
(Key Laboratory of Advanced Materials Technology of Ministry of Education, Southwest Jiaotong
University, Chengdu 610031, China)
ABSTRACT: At present, stent implantation is the main way for clinical treatment of atherosclerosis. However, after
收稿日期：2022–01–21；修订日期：2022–05–18
Received：2022-01-21；Revised：2022-05-18
基金项目：国家自然科学基金（31870955）
Fund：The National Natural Science Foundation of China (31870955)
作者简介：郝港桐（1997—），女，硕士研究生，主要研究方向为心血管材料表面改性。
Biography：HAO Gang-tong (1997-), Female, Postgraduate, Research focus: surface modification of cardiovascular materials.
通讯作者：陈俊英（1968—），女，博士，教授，主要研究方向为材料表面工程。
Corresponding author：CHEN Jun-ying (1968-), Female, Doctor, Professor, Research focus: materi
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引文格式：郝港桐, 陈俊英, 李莉, 等. 钛表面PAMAM-BVLD/TPS修饰层构建及TPS浓度对生物相容性的影响[J]. 表面技术, 2023, 52(2): 343-351.
HAO Gang-tong, CHEN Jun-ying, LI Li, et al. Construction of PAMAM-BVLD/TPS Modification Layer on Titanium Surface and Effect of TPS Concentration on Biocompatibility[J]. Surface Technology, 2023, 52(2): 343-351.
·344·表面技术 2023年2月
implantation, restenosis, thrombosis, inflammation and other problems may lead to treatment failure because the surface biocompatibility of implant materials does not meet the clinical requirements. Surface modification is one of the main methods to improve the biocompatibility of materials. At present, since the functional molecules modified by single function molecule can no longer meet the requirements of implant materials, the modification of multiple biomolecules on the surface of scaffolds has become a new hot spot. Therefore, the work aims to select anticoagulant molecule BVLD (Bivalirudin) and the endothelial- promoting molecule TPS (TPSLEQRTVYAK peptide) to construct BVLD/TPS modification layer on titanium surface and study the effect of TPS concentration
on the biocompatibility of titanium surface, so as to obtain the optimal TPS concentration. For covalent construction of PAMAM-BVLD/TPS modification layer, titanium as a cardiovascular metal implant material, was firstly polished and then activated by NaOH to create a large number of hydroxyl reactive functional groups for electrostatic binding of positively charged PAMAM. Subsequently, according to the amino and amidation reaction of PAMAM terminal, BVLD and TPS were covalent immobilized onto surface, the PAMAM-BVLD/TPS modification layer was thus formed.
Scanning electron microscopy (SEM) was used to observe the changes of the surface morphology of titanium. It was found that the surface roughness of titanium grafted with BVLD and TPS decreased. In immunofluorescence staining, the surface of the polypeptide grafted with FITC fluorescein gave off a large area of fluorescence. In FT-IR results, the successful graft of PAMAM could only be preliminarily judged. However, the successful graft of polypeptide could not be judged because the functional groups of the grafted molecules were similar. The acid orange experiment could further help to prove the successful graft of PAMAM. According to the Micro BCA experiment, the density of phenolic hydroxyl groups on the surface of the material was detected. The content of phenolic hydroxyl groups on the surface of the grafted peptide samples was significantly different from that of the contrast samples due to the unique phenolic hydroxyl group of polypeptide, proving t
he successful graft of the polypeptide. In the measurement of water contact Angle (WCA), the polypeptide molecule had better hydrophilicity than the other molecules, and with the increase of TPS concentration, the hydrophilicity was further improved. These experiments proved the successful construction of the BVLD/TPS modification layer. The effect of TPS concentration on the biocompatibility of the modification layer was studied in detail. In the platelet adhesion and activation experiment, the platelet activation degree on the titanium plane surface of the grafted polypeptide decreased, and the activation degree was the lowest when the TPS concentration was 3 mol/L. In the APTT experiment, the partial activation time of thrombin grafted with BVLD sample was still significantly longer than control sample, and the TPS concentration had no significant effect on the time. The APTT time of the modification layer was about 37 s, which was about 10 s longer than that of the control group. The experiment results of endothelial cell adhesion and proliferation disclosed that, compared with the control group, the number and activity of the endothelial cells adhered to the modification layer surface grafted by polypeptide increased, and the growth of the endothelial cells was excellent when the TPS concentration was 3 and 5 mol/L. Based on the above results, it was proved that the biocompatibility of modified titanium surface was optimal at the TPS concentration of 3 mol/L. Half body experiment showed that the modification layer could significantly inhibit thrombosis. Obviously, the co-immobilization of BVLD and TPS onto biomaterials surface, is expected to be used for the cardiovascular interventional materials with functionalization.
BVLD/TPS modification layer is successfully constructed on titanium surface, and the optimal concentration of TPS is preliminarily explored, that is, when the concentration of TPS is 3 mol/L, its blood compatibility and cytological evaluation are good, which can be used for the development and application of biological modification layer on titanium surface.
KEY WORDS: surface modification; Bivalirudin; endothelium-promoting; anticoagulantion; cytocompatibility
近些年来，心血管疾病占我国公民死亡率首位[1]，严重威胁人们的生命健康。方法主要有药物、手术以及介入。药物周期较长，效果不明显；手术对患者造成的损伤大、风险较高；相比之下，介入手术所需风险低，术后恢复时间短。血管支架植入是目前临床上心血管疾病的主要手段，然而，在支架植入晚期时，大多数支架都会引发再狭窄、血栓、炎症等一系列反应[2-4]。通过对材料表面改性，可有效改善支架材料的生物相容性。
目前，研究者通过在金属材料表面修饰功能分子，例如细胞外基质蛋白[5]、多肽[6]、肝素[7]、抗体[8]等，可有效改善支架材料的生物相容性。其中，作为三维球状大分子，聚酰酰胺树枝状分子（PAMAM）备受研究者关注。PAMAM外部官能团丰富，内部空腔具有一定的装载性，在药物、药物传递以及材料表面改性中应用广泛，在心血管材料领域应用有很大潜力[9-10]。然而，PAMAM生物相容性较差，需要对其进一步修饰，改善其血液及细胞相容性[11-13]。比
第52卷第2期郝港桐，等：钛表面PAMAM-BVLD/TPS修饰层构建及TPS浓度对生物相容性的影响·345·
掏耳器伐卢定（Bivalirudin，BVLD）是由人工合成的新型抗凝血临床药物，可与凝血酶发生特异性结合，直接抑制凝血酶活性，效果较肝素更为强大[14]。目前BVLD 作为肝素抗凝的替代药物之一，常被研究者用于血液接触材料表面抗凝修饰[15-17]。TPSLEQRTVYAK （TPS）属于功能性多肽，是于2007年Veleva等人筛选出来可与血液中内皮祖细胞（EPCs）特异性结合的多肽适配子[18]，2008年Veleva等人证实了TPS 可特异性粘附EPCs以及EPCs来源的内皮细胞（ECs）[19]。之后又有研究者证实，接枝TPS的材料表面支持血管内皮细胞的粘附及增殖[20]。然而，关于TPS浓度对于内皮细胞的影响未见报道。本研究拟将树枝状分子（PAMAM）吸附到钛表面，借助PAMAM端部的氨基基团，采用EDC-NHS体系，将抗凝分子BVLD、促内皮功能分子TPS引入，在钛表面构建PAMAM-BVLD/TPS修饰层，探究不同浓度TPS对构建层生物相容性的影响。
1 试验
1.1 材料与方法
试验主要用材料有：钛基质（ϕ10 mm，宝鸡有金属股份有限公司）、树枝状分子聚酰酰胺（PAMAM，晨源分子新材料有限公司）、BVLD（95%，上海科肽）、TPS（95%，鸿拓生物）、氢
氧化钠、EDC、NHS、酸性橙、MicroBCA试剂盒、APTT试剂盒等。
鱼苗孵化设备修饰层的构建方式如图1所示。具体操作步骤为：1）将纯钛打磨并抛光，再用无水乙醇、超纯水分别超声清洗5 min，并标记为Ti。
2）将Ti浸没于3 mol/L的氢氧化钠溶液中，在80 ℃条件下反应12 h，再用超纯水超声清洗5 min，获得碱活化处理后的Ti。
3）将碱活化处理后的Ti浸没于PAMAM溶液中（浓度为 1 mol/L），常温下反应12 h，并标记为Ti-OHP。
4）在浓度为0.1 mol/L的BVLD溶液中加入n COOH︰n NHS︰n EDC=1︰3︰5的NHS/EDC的羧基活化剂，将共混液体滴加到Ti-OHP样品表面，在常温下反应12 h，并标记为Ti-OHPB。 5）之后在一定浓度的TPS溶液中（浓度分别为1、3、5 mol/L）加入n COOH︰n NHS︰n EDC=1︰3︰5的NHS/EDC的羧基活化剂，将共混液体滴加到Ti-OHPB样品表面，常温下反应24 h，标记为Ti-OHPBT（TPS浓度）。
图1 双功能修饰层的制备过程
Fig.1 Preparation of dual-functional modification coating: a) dual-functional coating surface;
b) preparation process of BVLD/TPS modification layer
·346·
表 面 技 术 2023年2月
1.2 材料学表征
采用场发射扫描电镜（JSM 7800F ）观察材料的表面形貌。采用免疫荧光法对材料表面接枝的多肽进行定性检测。采用傅立叶红外光谱仪（NICOLET 5700）对样品表面的官能团结构进行分析。采用酸性橙方法检测材料表面氨基的变化量。采用Micro BCA 方法检测材料表面酚羟基的变化量。采用接触角测定仪对修饰前后材料表面水接触角的变化进行检测。
1.3 血液学评价
具体试验步骤为：取新鲜抗凝人血，以1 500 r/min 离心30 min ，收集上层液体富板浆（PRP ）；将试验样品浸泡于PRP 中（37 ℃，30 min ）；浸泡结束后，用生理盐水清洗3次，多聚甲醛液固定；采用荧光显微镜观察材料表面的血小板；将样品脱水、脱醇处理，并在干燥后喷金；采用场发射扫描电镜（JSM 7800F ）对不同样品表面的血小板形态进行观察。
取新鲜抗凝人血，按照 3 000 r/min 转速离心30 min ，收集上层液体贫板浆（PPP ）。再将材料浸泡于PPP 中（37 ℃，5 min ），采用APTT 试剂盒以及秒表检测并记录样品的活化部分凝血活酶时间。
1.4 体外细胞学评价
在材料表面体外种植内皮细胞（ECs ），种植密度为1×104 cells/mL ，种植时间为1、3 d 。通过荧光
显微镜（OLYMPUS ）观察样品表面EC 形态。使用CCK-8试剂检测样品表面ECs 活性。
2 结果及分析
2.1 形貌观察与免疫荧光染
扫描电镜可以直观反映样品接枝分子前后表面形貌的变化。由图2a 可得，经过碱活化后的钛片表面形成了100~200 nm 的网络孔洞状结构，与文献中报道相符[21]。样品Ti-OHP 表面有少量粘附的物质，相比之下，样品Ti-OHPBT 表面孔洞中有一些填充在其中的物质，但并不能确定具体是什么，因此需要进一步表征证明分子接枝的成功。免疫荧光染结果如图2b 所示。2种样品表面的荧光强度有很大区别，在样品Ti-OHPBT 表面，由于多肽修饰了FITC 荧光素，因此在材料表面发出大面积且均匀的绿荧光。反之，样品Ti-OHP 表面并未有绿荧光发出。该结果表明功能分子成功接枝到材料表面。
图2 接枝样品对改性钛表面形貌的影响
Fig.2 Effect of grafted specimens on the surface morphology of modified titanium: a) surface
morphologies of specimens; b) immunofluorescence pictures of specimens
2.2 FT-IR 与基团定量
图3为傅里叶红外漫反射结果。在3 300 cm –1波长附近处，样品Ti-OHP 和Ti-OHPBT 都有吸收峰，
该峰为羟基（—OH ）的伸缩振动峰。由于样品Ti-OHP 表面有大量的胺基，引入了N —H 伸缩振动，特征伸缩振动吸收峰会在3 680~3 230 cm –1处发生重叠；而在Ti-OHPBT 表面，由于功能分子带有苯环以及羧
第52卷第2期郝港桐，等：钛表面PAMAM-BVLD/TPS修饰层构建及TPS浓度对生物相容性的影响·347·
基，引入了C—H伸缩振动，使该处峰变得相对宽而平缓。在1 663、1 532 cm–1波长处，分别出现了酰胺Ⅰ带C==O的伸缩振动吸收峰及酰胺Ⅱ带的C—N、N—H面内弯曲振动吸收峰，可以初步判断PAMAM 成功接枝。同时，在1 663、1 532 cm–1处，Ti-OHPBT 表面的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰有所加深，这是由于BVLD和TPS都具有酰胺键。因此，该结果表明BVLD和TPS接枝成功。
酸性橙定量检测样品表面氨基密度结果如图4所示。本试验以Ti-OHP作为对照组，其表面氨基密度大约为12.5 nmol/cm2，这是由于PAMAM端部有大量的氨基基团。相比对照组，Ti-OHPBT表面氨基密度无显著性差异。这是由于修饰层表面的功能分子BVLD和TPS结构中也有氨基基团。
通过Micro BCA法定量检测表面酚羟基密度，结果如图5所示。本试验以Ti-OHP作为对照组，Ti-OHP
BT表面酚羟基密度为0.07~0.12 nmol/cm2，且随着TPS浓度的增加，材料表面酚羟基密度也随之增加，相比对照组，有显著性差异。本试验说明功能分子在材料表面接枝成功。
图3 各步处理红外光谱图
Fig.3 FT-IR spectra of treated titanium in each step
图4 样品表面氨基密度
智能支付Fig.4 Density of amino groups on specimen surface
开放式基金预测2.3 水接触角测量
不同样品表面水接触角的变化如图6所示，其反
图5 样品表面酚羟基密度
Fig.5 Density of phenolic hydroxyl groups
on specimen surface
图6 各样品表面的水接触角变化
Fig.6 Water contact angle of different
specimen surfaces
映了材料表面亲疏水性的变化。由图6可知，Ti-OHP 表面的水接触角为30.4°±0.9°，相较纯钛表面（水接触角约为56°[22]），亲水性有很大提升。这是由于碱活化后，钛表面为网状多孔结构，且PAMAM端部有大量的亲水性基团氨基。Ti-OHPBT1表面水接触角略有增加，这是由于BVLD和TPS分子中有疏水性结构苯环。随着TPS浓度的升高，材料表面的水接触角减小，这是因为BVLD和TPS分子还有大量的亲水性基团，如氨基、羧基等[23]。目前有相关研究表明，提高材料表面的亲水性，在一定程度上可以有效改善材料表面的生物相容性[24]。
阻尼电机2.4 血小板粘附与激活
血小板荧光图和扫描电镜图见图7。Ti-OHP表面血小板数量相对较多，且大部分血小板出现了严重激活，呈现铺展状态。Ti-OHPBT1、Ti-OHPBT3、Ti-OHPBT5表面的血小板数量均较少，且在Ti- OHPBT3表面粘附的血小板激活程度较低，呈圆球形，几乎无伪足伸出，表明了其具有良好的血液相容性[25]。
2.5 活化部分凝血活酶时间检测
不同样品的活化部分凝血活酶（APTT）时间如
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