胸腺五肽的固相合成

第49卷第7期2021年4月

广州化工

Guangzhou Chemical Industry

Vol.49No.7

Apr.2021胸腺五肽的固相合成

唐文力，李宜航

(常德职业技术学院，湖南常德415000)

摘要：采用哌睫脱Fmoc法固相合成胸腺五肽，通过采用Fmoc保护的Wang树脂，利用紫外-可见光分光光度法测量树脂上裸露氨基的含量，从而定量监测脱保护反应发生的程度以及树脂的取代率。目标产物经高效液相和质谱表征分析，该胸腺五肽产物产率为88.67%，纯度为98.54%。该研究采用的哌睫脱Fmoc法固相合成胸腺五肽取代率较高，且回收率也较高，可应用于工业批量生产。

关键词：胸腺五肽；固相合成；多肽合成

中图分类号：R914.5文献标志码：A文章编号：1001-9677(2021)07-0035-03

Solid-phase Synthesis of Thymopentin

TANG Wen-li,LI Yi-hang

(Changde Vocational Technical College,Hunan Changde415000,China)

Abstract:The piperidine de-Fmoc method was used to synthesize thymopentin in solid phase.By using Fmoc-protected Wang resin,the content of exposed amino groups on the resin was measured by ultraviolet-visible light spectrophotometry,so as to quantitatively monitor the degree of deprotection reaction and the replacement rate of the resin. The target product was characterized and analyzed by high performance liquid phase and mass spectrometry.The yield of the thymopentin product was8&67%and the purity was9&54%.The piperidine de-Fmoc solid-phase synthesis of thymopentin used in this study has a higher substitution rate and a higher recovery rate,which can be applied to industrial mass production.

Key words：thymopentin；solid phase synthesis；peptide synthesis

随着医药产业的快速发展，多肽类药物的发展正越来越引起医药界的关注。胸腺五肽在医用上良好的

产业前景使得人们将注意力纷纷集中在大规模生产上，由于采用生物提取会受材料来源限制，而基因表达技术运用在小分子肽上存在困难等问题，其分子式简单的特点使化学法合成胸腺五肽独具优势，固相化学合成成为获得胸腺五肽的重要途径。

近年来，固相法得到了很大发展，Boc法[1](Boc：叔丁氧辣基)和Fmoc固相法叨(Fmoc：9-笏甲氧按基)。以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。本实验采用Fmoc固相法，Fmoc法避免了接肽时反复使用强酸的弱点，每次去保护时释放出可检测的化合物以及没有腐蚀性试剂参与反应，其温和的反应条件使得反应过程温和可控。此外，本研究采用的Rink树脂合成片段还可以方便自动化生产；Rink树脂可以回收重复利用；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应；降低了生产成本。

1仪器与试剂

Waters2695型高效液相谱、MiHi—Q超纯水系统，德国默克密理博公司；紫外分光光度计、GL-150干式恒温器(block heater)、XW-80A旋涡混合器，上海精科实业有限公司，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平TP-214，丹佛仪器有限公司(d=0.1mg)；GL-150干式恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；R-100型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

Wang Resin(AR，南开和成科技有限公司，交联度1%，取代率0.47mmol/g)、二环己基碳二亚胺(DCC)、卡特缩合剂(BOP)、二甲氨基毗®(DMAP)均采购自苏州昊帆生物股份有限公司、甲醇、醋酸酹、毗睫、二氯甲烷均采购自天津市大茂化学试剂厂。

2实验方法

2.1试剂配制

2.1.120%pip/DMF溶液(脱保护液)的配制

20%哌睫DMF溶液：取100mL哌睫溶于400mL DMF中。

卡片打印

2.1.2磷酸缓冲液的配制

将2.738g NaH2PH4•2H20(M=156.01)和9.834g Na2HPH4•12H2O(M=35&14)溶于900mL纯水中，溶解后，再加入100mL甲醇，混匀。制成磷酸缓冲液。

2.1.3裂解液的配制

TFA(三氟乙酸)：TIS(三异丙基硅烷)：H20(纯水)=95: 2.5:2.5(体积比)，制成裂解液。

第一作者：唐文力(1992-)，男，助教，主要研究方向为多肽药物合成及医用材料研发。

36广州化工2021年4月

2.1.4苗三酮反应所需溶液的配制

(1)溶液a的配制

溶液1：取4g苯酚溶于1mL无水乙醇(80%苯酚/无水乙

醇溶液[w/v])，加热至溶解。

溶液2：取0.2mL KCN(0.001mol)溶于9.8mL毗I®中。

溶液a：混合溶液1，溶液2。

(2)溶液b的配制

称500mg苗三酮溶于10mL无水乙醇中(5%苗三酮/无水

乙醇溶液，[w/v])，密闭避光保存。

检验时加2滴溶液a,1滴溶液b。

2.2标准曲线的绘制

以Fmoc-Ala-OH为标准物质，准确称量Fmoc-Ala-OH

(带Fmoc的丙氨酸)39.5mg，用1mL20%pip/DMF处理

20min，取其中0.1mL用DMF稀释到10mL配置成浓度依次

为2]|xmol/L A42|xmol/L、68|xmol/L、85|xmol/L、106pimol/L、

177pumol/L的混合溶液，放置待用，见表1。

表1不同浓度的Fmoc-Ala-OH溶液及吸光度

Table1Fmoc-Ala-OH solutions of different concentrations and

their absorbance

试管标号浓度标准溶液

体积/mL

DMF体积/mL Abs

121150.18

242240.34

363330.5

485420.67

5106510.82

6127600.98

制成标准曲线见图1。

图1丙氨酸标准溶液曲线

Fig.1Alanine standard solution curve

2.3胸腺五肽合成

2.3.1Fmoc-Tyr(tbu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-树脂的合成

称取树脂0.5g于10mL反应器中，依次称量Fmoc-Tyr (tbu)-OH0.25mmol,230mg,DCC0.25mmol,103mg, DMAP0.025mmol,3mg o溶于2.5mL DMF O倒入反应器中，溶胀30min后，力02mL DMF摇晃3h，接着树脂用DMF洗四遍，甲醇洗四遍，抽极其干。取2mg树脂于1.5mL离心管中，加1mL20%pip/DMF溶液处理20min，稀释10倍，测吸光度将5mL此稀释液加入50|xL原液(取自1mL20%pip/DMF 溶液)，测吸光度，并根据标准曲线计算取代率。

取1.25mmol醋ff(118jjl L), 1.25mmol毗®(100|±L), 7mL DMF—并倒入反应器，反应30min o抽去反应液，并用DMF洗涤2次、IPA洗涤3次、DMF洗涤4次。洗涤完成后，取少许树脂，滴入2.1.4配制的苗三酮试液，并用干式加热器105弋加热约3min，检验溶液呈蓝黑。

称Fmoc-Val-OH0.5mmol,170mg o BOP0.5mmol, 221mg,3mL DMF中斡旋溶解，加DIEAO.5mmol,88|jl L o斡旋混匀。于室温下放置10min后倒入反应器，反应2h。反应完成后，用DMF洗涤4遍，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入2.1.4配制的苗三酮试液，并用干式加热器105七加热约3min，检验溶液呈无，既反应完全。

得到Fmoc-Tyr(iBu)-Vai-树脂后，量取约7mL脱帽试剂20%pip/DMF溶液，倒入反应器中，反应20min，抽去反应液，DMF洗涤4次，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入2.1.4配制的苗三酮试液，并用干式加热器105%加热约3min，检验溶液呈蓝黑，既获得Tyr(£Bu)-Vai-树脂。在获得Tyr(^Bu)-Vai-树月旨后，按照上述缩合反应方法，依次Tyr(iBu)-Val-树脂上连接氨基酸保护单体：Fmoc-Asp(tBu)-OH A Fmoc-Lys (BOC)-OH、Fmoc-Arg-OH后得到Fmoc-Tyr(tbu)-Vai-Asp (^Bu)-Lys(BOC)-Arg-树脂。

2.3.2胸腺五肽粗品制备

取2.3.1步骤制备的Fmoc-Tyr(^Bu)-Vai-Asp(^Bu)-Lys (BOC)-Arg-树脂置于干净的10mL玻璃反应器中，用配制的高酸裂解液裂解树脂。每次加入约2mL裂解液，每次裂解时间为20min，共裂解三次。将每次裂解后的滤液收集在同一100mL的离心管中。

在滤液加入约10mL60%的乙醵溶液，震荡混匀。该溶液在4七下，9000r/min高速离心5min o离心后倒出上清液(弃)，再加入约10mL60%的乙醞溶液，洗涤析出固体，再重复离心。共离心三次。最后一次倒出上清液后，将离心管置于通风橱中风干。收集风干后的五肽样品，置于1.5mL离心管中备用。

3结果表征

3.1树脂取代率的测定

根据丙氨酸标准溶液C-Abs曲线，将A301nm(y)=0.375带入y二0.0075x+0.0237，可以计算氨基的浓度(x)为8.97pimol/L0取干燥树脂2mg测吸光度，考虑到稀释了100倍，则

取代率=&97pimol/Lx100/1000/2mg=0.449mmol/L

3.2树脂回收率的计算

脱保护后的树脂，称重，质量为m1=8mg，离心，置于通风橱中风干后，称重，质量为m2=2.3mg，贝[|：

理论质量m3=8mgXO.47mmol/gx680=2.556mg

树脂回收率=2.3mg/2.556mg=89.98%

3.3高效液相谱级质谱分析

对胸腺五肽粗品及标准品进行HPLC分析，谱柱为Krosmaill00-5C18柱(250mmX9.4mm,5|JLm)；流动相A相(0.IM NaH2PO4/H2O)，洗脱液B(MeCN-H2O=l:1)；梯度洗脱：0〜30min；70%B-40%A，流速为 1.0mL/min，检测波长为215nm，其纯度为98.54%，见图2〜图4。

机床顶针0.06-

V°'04_I

0.02-I

0U1-----------------------1-------------1-------------1汽车中央扶手

010********

t/min

图2胸腺五肽标准品液相谱图

Fig.2Liquid chromatogram of standard

thymopentin

第49卷第7期唐文力，等：胸腺五肽的固相合成37

0.15

0.1

0.05

0510******** 35

t/min

图3胸腺五肽标准品液相谱图

Fig.3Liquid chromatogram of standard thymopentin T:FTMS+p ESI Full ms[100.00-2000.00]

LYX-XX5T_130514095511#4RT：O.O5AV：1NL：2.75E6

超导限流器m/z

图4胸腺五肽粗品质谱图

Fig.4Crude quality spectrum of thymopentin

4结论化合物为胸腺五肽。再根据树脂取代率和回收率的计算可知，哌睫脱Fmoc法固相合成胸腺五肽产率为88.67%，纯度为9&54%。

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(1)根据根据高效液相谱图和氢谱分析图可知，合成的(上接第34页)

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