30
第29卷第4期
1997年7月
生物化学与生物物理
ACTABlOCHIMI(2AetBIOPHYS1CASIN1CA
(毛)?
V0l,g9.NO4
Julyt1997
led贴片模组嗜热脂肪芽孢杆菌DNA解链蛋白BstH2.
的纯化及性质研究
张小华陆长德
中国科学院上海生物化学研究所，上梅~00031),l
摘要
嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussgearothermhilus)为材料，通过PolyminP沉淀，琉酸铵分级及DEAE纤维索，磷酸纤维素,Blue—Sepharose,FPLCMonoQ,FPLCSuperose12等柱层析, 布鞋套
得到了部分纯化的DNA解链蛋白BstH2.BstH2具有受DNA促进的A TP酶活力，不同类型的棱酸对BslH2的ATP酶活力的促进作用不同.BstH2在55C有最高ATP酶活力.这种活力
受大肠杆菌单链DNA结合蛋白的抑制及随离子强度的增强而下降BstH2具有DNA解链括
力.不但能解开部分双链DNA，也能解开钝柬端的双链DNA，解链反直需要ATP和Mg¨.
大肠杆菌单链DNA结台蛋白促进DNA髌链反直.
撼,：孢…解链'竹———～—～
BstH2
———,～
兰也
以嗜热脂肪芽孢杆菌为材料.我们得到了两种DNA解链蛋白BstHI和BstH2.我们已报道了BstHl的分离纯化及性质：本文报道RstH2的分离纯化及性质研究.
材料和方法
1.1材料和试剂
1_1.1茵株嗜热脂肪芽孢杆菌由德国马普分子遗传所K.H.Nierhaus教授惠赠. 1.1.2层析材料及试荆DE一81纸,DEAE纤维素磷酸纤维素由Whatman出品. Blue—Sepharose,FPLCMonoQ及Superose12购自Pharmacia.小牛胸腺DNA,Poly' (dA),Poly(dT)及酵母tRNA购自Pharmacia.M13mp19ssDNA及RFDNA按《分子克
隆》制备.ATP购自Fluka.[732P~A TP购自Amersham.其他化学试剂均为分析纯..
1.1.3寡核苷酸片段合成以下寡核苷酸片段在本实验室DNA合成仪(ABI一
391EP)上用亚磷酰胺三酯法合成.
Pl:5TAA TCATGGTCATAGCTGTTTCCTGCAGG3'
P2:5GTGAA TTCAGATCTGTAATCA TGGTCA TA3
收稿日期.1996—09l1；接受14期:199611—12.
,
第4期嗜热脂肪芽孢杆菌DNA解链蛋白BstH2的纯化及性质研究357
P3:5CCTGCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACAGATCTGAA TTCAC3
1.1.4酶和蛋白T4多聚核苷酸激酶，大肠杆菌单链DNA结台蛋白(E.coliSSB)
购自Promega大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow片段)购自Pharmacia.
1.2方法
1.2.1依赖或受DNA促进的A TP酶活力分析依赖或受DNA促进的ATP酶活
力分析同前文一BstH2的ATP酶活力单位定义：在上述反应体系中.10rain能水解1
nmolATP的BstH2的量定义为1单位.
1.2.2DNA解链反应底物的准备(1)部分双链DNA底物的准备同前文..(2)钝
末端双链DNA底物的准备:5末端标记P3，将P3与P2配对并以Klenow酶补平，聚丙
烯酰胺凝胶电泳纯化.
1.2.3BstH2的DNA解链活性分析BstH2的DNA解链活性分析同前文_l-
结果
2.1BstH2的分离纯化
所有的操作均在4.C或低于4℃进行.
2.1.1粗抽提样品的制备粗抽提细胞破碎,polyminP沉淀，硫酸铵沉淀同前
文.5O饱和度硫酸铵沉淀溶于缓冲液A(20mmoI/LTris—HC1,pH7.5,10甘油,
1mmol/LEDTA,5mmol/L2巯基乙醇.0.3mol/LNaCI).沉淀溶于BufferA后在BufferA中透析.
2.1.2DEAE纤维素柱层析以缓冲液A平衡DEAE纤维素.将透析样品上柱并多功能锤子
以柱平衡缓冲液A洗柱，收集直接流出液为Fraction1,Fraction1对缓冲液B(10 mmo|/LKPi,pH6.5,10甘油,1mmol/LEDTA,5mmo|/L2-巯基乙醇,50mmol/L
KC1)透析.
2.1.3磷酸纤维素柱层折以缓冲液B平衡磷酸纤维素柱，将透析后的FractionI
上柱，以缓冲液B充分洗柱，收集直接流出液并以6O饱和度的硫酸铵沉淀，沉淀溶于
缓冲液C(20mmol/LTris—HC1,pH7.6,10甘油,1mmol/LEDTA,5mmol/L2-巯
基乙醇,50mmol/LKC1)并透析为FractionII.
2.1.4DEAE纤维素柱层析将FractionII上DEAE纤维素柱(缓冲液c平衡),
充分洗柱后梯度洗脱(50～450mmol/LKCI)，分部收集，测定各组分受DNA促进的ATP酶活力台并180~220mmol/LKC1洗脱的各组分为FractionIII,FractionIII在缓冲液D(20mmol/LTrisHC1,pH7.6,10甘
油,2mmol/LMgC12,5mmol/L巯基
乙醇,50mmol/LKC1)中透析.
2.1.5BlueSepharose柱层折以缓冲液D平衡Blue—SepharoseCL4B柱，然后
将FractionIII上柱，充分洗柱后梯度洗脱(5O～1000mmol/LKCI)，分部收集，测定各
组
分受DNA促进的ATP酶活力.合并2OO～360mmolKCI洗脱的各组分为FractionIV.
以60饱和度的硫酸铵沉淀，沉淀溶于缓冲液E(20mmol/LTrisHCI,pH7.6,10
甘油,0.1mmol/LEDTA.1mmol/LDTT,50mmol/LKC1)
358生物化学与生物物理第29卷
2.1.6FPLCSuperose12进一步分离纯化FractionIV将FractionIV上FPLC Superose12(缓冲液E平衡)，分部收集，测定各组分受DNA促进的ATP酶活力，台并
活力组分为FractionV，并用Amiconcentri30浓缩样品.
2.1.7FPLCMonoQ分离纯化FractionVFractionV上FP1CMonoQ(缓冲液
E平衡)，梯度洗脱(150～350mmol/LKC1)，分析各组分受DNA促进的ATP酶活力. 合并240～300mol/LKC1洗脱的ATP酶峰的各组分为FractionVI.将FractionVI在缓冲液F(20mmol/LTris—HC1,pH6.0,10甘油,0.1mmol/LEDTA,1mmol/L
DTT)中透析3～4h，并用Amiconcentri3O浓缩将FractionVI上FPLCMonoQ(缓
冲液F平衡)，梯度洗脱(300~400mmol/LKC1)，具有依赖DNA的ATP酶活力的蛋白
为BstH2.表1所列为BstH2分离纯化过程中总活力及比活力的变化情况., Table1PurificationofBstH2fromBacillussttarothermophituJ ATPaseaetlvitywasassayedinthepresenceorabsenceofDNAundeTstKndardcotaditionde scribedin.Materiats
andMeth~s"DNAdependentA TPaseactivitywasdetertnJnedbysubtractingtheactivityinth eabsencefromthatin
thepresenceolDNA.
核桃剥壳机
松香酸
DNA—dependentA TPaseactivity…nothedeterminedheeauseoftheabundantpresenceoIDNA—independent
ATPKse.
…DNAhelicaseactivitycanbedetectedatthisstep.
2.2BstH2的基本性质
2.2.1BstH2的ATP酶活力需要Mg抖并受DNA促进我们测定了BstH2的
ATP酶催化A TP水解所需要的条件.如表2所示,BstH2的A TP酶活力需要DNA 和
二价金属离子Mg.Ca和Mn可以替代Mg，不加Mg而加入EDTA可进一步
抑制ATP水解，表明酶本身可能结合少量Mg.导尿管原理
2.2.2不同类型的核酸对BstH2的ATP酶活力起着不同的促进作用我们分析了不同核酸对于BstH2的A TP酶活力的促进作用.如表3所示，单链DNA，变性的小牛胸
腺DNA及Poly(dT)具有最高的促进作用；双链环状M13mpl9的RFDNA也有一定的
促进作用；线状天然小牛胸腺DNA的促进作用也较大，可能它带有较多断裂的末端单
第4期嗜热脂防芽孢杆菌DNA解链蛋白BstH2的纯化及性质研究359
链;Poly(dA)的促进作用比Poly(dT)稍差;
作用很弱.
Table2RequirementsforA TPase
activityofBstH2'
寡聚DNA也有促进作用；而tRNA的促进
Table3EffeCtofvatiousnucleicacids
onATPaseactivityofBstH2'
ReagentADPproduced(pmo1)NucleicacidADPproduced(pmoD
Cnmp【et
DNA
—
Mg
Mg.+Ca.一(6mM)
Mg卜.一Mn一(6mM)
Mg,+10mMEDTA
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议