陈千权; 王野影
贴易【期刊名称】《《河南农业科学》》
【年(卷),期】2019(048)009
【总页数】8页(P90-97)
【关键词】四纹豆象; 种密度; 免疫信号转导相关基因; 抗菌肽; Toll; IMD 【作 者】陈千权; 王野影
【作者单位】贵州师范大学生命科学学院 贵州贵安550025
【正文语种】中 文433m天线
【中图分类】S433.4
高种密度环境易导致寄生和疾病发生，因此，随着种密度增加，个体感染疾病的概率也相应增加。在长期进化和自然选择过程中，个体发展出能感知种密度并能根据种密度调整免疫反应的能力[1]。与病原体感染相似，高种密度可提升昆虫的预防性免疫能力。昆虫免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，前者主要包括抗菌肽和酶联反应，后者主要包括血细胞防御反应，如吞噬作用和封闭作用[2-3]。由于缺乏后天免疫系统，昆虫能识别非自身抗原并能迅速放大感染信号。感染信号主要通过Toll和IMD(Immune deficiency)通路进行转导，进而激活脂肪体中表达抗菌肽并释放到血淋巴中。先天免疫系统是昆虫对抗细菌、真菌和病毒等病原体入侵的重要防线。革兰氏阳性菌和真菌可激活Toll信号通路而激活抗菌肽表达，而革兰氏阴性菌主要通过激活IMD信号通路而激活抗菌肽表达[4]。果蝇中Toll-1和Toll-9过表达可诱导抗菌肽表达[5]，Toll-5和Toll-9能激活抗真菌肽(Drosomycin)的表达[6]。病毒可通过Toll-7而激活抗病毒自噬反应[6]，通过自噬抑制病毒复制[7],而Toll-8负调控呼吸道上皮抗微生物反应[8]。Toll信号通路除参与免疫信号转导外也调控发育过程。Toll-2参与卵泡细胞及唾液腺发育[9]，Toll-7和Toll-10调控胚胎发育过程中前后轴延伸[10]，Toll-8参与胚胎时期中枢神经系统和腿发育[9]。与此相似，家蚕Toll-1和Toll-2在卵巢中高表达，二者可能在胚胎发育中具有重要作用[11]。Toll信号通路相关基因对昆虫生存至关重要，因此，其相关基因可作为有害昆虫管理的靶基因[12]。
四纹豆象是全球分布的重要仓储害虫，依赖种密度展现明显的表型可塑性，即在高种密度条件下，个体行为更活跃、个体发育更快速、性成熟更早、产卵更早、产卵数量更少[13]。四纹豆象免疫信号转导相关基因尚未鉴定，相关基因的表达量与种密度的关系仍不清楚。鉴于此，本研究尝试从四纹豆象转录组数据中鉴定免疫信号转导及抗菌肽相关基因，并阐明这些基因表达量与种密度的关系。家用电视天线
智能仓储立体仓库设计1 材料和方法
1.1 昆虫饲养
野生四纹豆象经形态和细胞素C氧化酶亚基Ⅰ测序鉴定后，于2016年7月将其引入并饲养。组织培养瓶(0.2 L)盖上开5 cm × 5 cm孔，用纱布封住，既保证透气又防止四纹豆象逃逸。在盛有100粒黑绿豆的瓶中置入2对豆象，以建立低密度试验种。在盛有相同数量黑绿豆的瓶中置入15对豆象，以建立高密度试验种。饲养5代后开始试验，每个密度设立3个生物重复。饲养条件：温度为(30±2)℃，光周期L∶D为16∶8，相对湿度为50%～70%。
1.2 Toll、IMD与抗菌肽基因的鉴定
从FlyBase中下载黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Toll与IMD相关蛋白质序列：Toll-1(CG5490)、Toll-2(CG8896)、Toll-3(CG1149)、Toll-4(CG18241)、Toll-5(CG7121)、Toll-6(CG7250)、Toll-7(CG8595)、Toll-8(CG6890)、Toll-9(CG5528)、IMD(CG5576)、肽聚糖识别蛋白LC[PGRP-LC(CG4432)]。从NCBI中下载赤拟谷盗(Tribolium castaneum)Toll、IMD相关蛋白质序列：Toll-1(Tc000176，NCBI：LOC655507)、Toll-2(Tc004452，NCBI：LOC662755)、Toll-3(Tc004438，NCBI：LOC656158)、Toll-4(Tc004439，NCBI：LOC656071)、Toll-6(Tc004895，NCBI：LOC660697)、Toll-7(Tc004474，NCBI：LOC661135)、Toll-8(Tc004898，NCBI：LOC660808)、Toll-9(Tc033974，NCBI：LOC662131)、Toll-10(Tc004901，NCBI：LOC661030)、IMD(XP_008199405.1)、PGRP-LC(XP_008192547.1)。
从FlyBase中下载黑腹果蝇抗菌肽蛋白序列：Drosomycin(CG10810)、Defensin(CG1385)、Cecropin A1(CG1365)、Cecropin A2(CG1367)、Drosocin(CG10816)、Metchnikowin(CG8175)。从NCBI中下载鞘翅目昆虫抗菌肽蛋白序列：黄粉虫(Tenebrio molitor)Tenecin-1(BAA04552.1)，东北大黑鳃金龟(Holotrichia diomphalia)Holotricin-1(2107186A)，三开蜣螂(Copris tripartitus)Coprisin(ABP97087.1)，
Zophob atratus Defensin B(AAB20745.1)、Defensin C(AAB20746.1)，古铜异丽金龟(Anomala cuprea)Defensin A(BAD77966.1)、Defensin B(BAD77967.1)，犀角金龟(Oryctes rhinoceros)Defensin(BAA36401.1)，独角仙(Allomyrina dichotoma)Defensin(AAB36306.1)，Acalolepta luxuriosa Defensin 1(AAK35160.1),Cecropin(BAD66670.1)。鉴于缺乏鞘翅目昆虫富含脯氨酸抗菌肽信息，而鞘翅目与膜翅目亲缘关系相对较近，下载相关膜翅目抗菌肽蛋白序列：意大利蜜蜂(Apis mellifera)Apidaecin-1(P35581.1)、Apidaecin-2(Q06601.1)、Abaecin(NP_001011617.1)，红牛头犬蚁(Myrmecia gulosa)Formaecin(P81437.1)，Bombus pascuorum Apidaecin(P81464.1)、Abaecin(P81463.1)，Pteromalus puparum Abaecin-like(ABS44869.1)。
合成氨变换工段
从NCBI下载四纹豆象腹部转录组序列[14]。在Bioedit中通过本地tBLASTn比对鉴定相关基因，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列(bi.v/orffinder/)后，在Molecular Evolutionary Genetic Analysis software version 6(MEGA 6)中经多重比对(ClustalW)后构建最大似然(Maximum likelihood)进化树，重复次数为1 000次。蛋白质序列之间的一致性(Identities)、相似性(Positives)和间隙(Gaps)通过Bioedit软件计算。蛋白质
电子智能印章结构域采用SMART程序(bl.de/)预测。
1.3 表达量分析
四纹豆象腹部组织经液氮速冻并转移至-80 ℃保存，部分组织样品送北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序，以特定基因片段数量除以其长度后对上述所有序列数量的比值(Fragments per kilobase of exon per million reads mapped，FPKM)衡量基因表达量。以t检验判定相应基因在高密度体和低密度体中的表达水平是否存在显著差异。
2 结果与分析
2.1 四纹豆象Toll与IMD相关基因的鉴定
面对革兰氏阳性菌和真菌时，昆虫通过Toll信号通路提升预防性免疫，而面对革兰氏阴性菌时，昆虫通过IMD信号通路提升预防性免疫。与病原体感染相似，高种密度可提升昆虫的预防性免疫。为揭示种密度调控四纹豆象免疫反应的信号通路，从四纹豆象腹部转录组数据中鉴定到Toll信号通路的关键受体基因Toll-1、Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10；IMD信号通路的胞内关键信号分子基因IMD和受体基因PGRP-LC(肽聚糖识别蛋白LC
基因)(表1)。
表1 四纹豆象Toll与IMD基因序列号Tab.1 Sequence numbers of Toll and IMD genes in Callosobruchus maculatus基因名称Genename序列号SequencenumberToll-1GEUD01095860.1Toll-3GEUD01140467.1Toll-6GEUD01030320.1Toll-7GEUD01100239.1Toll-8GEUD01046562.1Toll-10GEUD01043542.1IMDGEUD01053287.1PGRP-LCGEUD01085190.1
通过转录组所得Toll相关基因的部分序列，Toll-1、Toll-8、Toll-10序列较短而Toll-3、Toll-6、Toll-7序列较长(图1A)。将四纹豆象Toll基因序列翻译为蛋白质序列后进行结构域预测，发现Toll-1有3个富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats，LRR)、3个典型富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats typical，LRR_TYP)。Toll-3有9个富含亮氨酸重复、3个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的N端结构域(Leucine-rich repeat N-terminal domain，LRR-NT)、1个跨膜区(Transmembrane region，TR)、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域(Toll-interleukin 1-resistance，TIR)。Toll-6有17个富含亮氨酸重复、4个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的C端结构域(Leucine-rich repeat C-terminal domain，LRR-CT)
、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-7有15个富含亮氨酸重复、6个典型富含亮氨酸重复、2个富含亮氨酸重复的C端结构域、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-8具有3个富含亮氨酸重复、1个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-10具有12个富含亮氨酸重复、5个典型富含亮氨酸重复。TIR结构域长度为140个氨基酸左右，是信号传导所必需的，经序列比对发现，35个位点氨基酸高度保守(图1B)。
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