Variable
ANALYSIS
浓缩血小板制品制备方法解析
Analysis of preparation methods for concentrated platelet products
浓缩血小板(platelet concentrate，PC）制品，是一类以PRP（富血小板血浆）、PRF（富血小板纤维蛋白）、CGF（浓缩生长因子）等为代表的一类血小板浓缩物。浓缩血小板（EPT）技术包含了血小板浓缩物的制备、分离、提取、活化、应用等方面的技术，也是生物（细胞）技术，被称为医学的“新第三支柱”。
Part电解离子接地棒 01
传统PC制剂的发展
当下关注再生医学EPT技术的同道越来越多，尤其是对PRP似乎耳熟能详，可是真正做到标准化地制备却是一门学问。
PRP的制备有机采法和手工法。机采法即采用血细胞分离机，患者（求美者）血小板≥150Ⅹ109/L是机采指征之一，需输血科、麻醉科等在心电监护下完成采集。其优点是血小板浓度高，白细胞和红细胞的含量较少，污染可能性低；缺点是采集时间长、成本高，损伤大。有医院一次采集1-2个单位的浓缩血小板保存在输血科供临床做非回输时用，正常保存的血小板从离体后到回输给患者的时间一般不能超过5天，而我们做抗衰修复如中胚层注射或涂抹时应用浓缩血小板的频次一般是3-4周/次，每次用量5ml左右，那我们就要考虑2个问题：
1、机采血小板的保存超过了常规保存期，对血小板的质量是有影响的，如果是冰冻保存，添加的保存液对组织的影响亦不能忽视，当然，我们做抗衰修复时主要是利用其激活后释放的各种生长因子、趋化因子和细胞因子来发挥其生物学活性作用，理论上讲冻融法也是血小板激活的一种方式，但低温保存或反复冻融的血小板其生长因子浓度及生物学活性规律如何？与保存在患者（求美者）体内现制现用的浓缩血小板之间的生物学活性是否有区别？这些都是值得深入、系统研究的课题；ruu
2、最低1个单位的机采血小板容量是30ml左右，每次用量5ml的话，一个单位的机采血小板可抽取6次左右，这种历时几个月的反复抽取的过程也是容易导致污染和交叉感染的风险因素，故机采法临床应用受限。手工法其优点是成本低廉、获取方便、无需输血科，缺点是其制备相对繁琐、PRP质量不稳定。
从相关文献检索到的国内外研究团队制备PRP的方法略举以下5种：
②Petrungaro法：2次离心，1500g 6分钟，1000g 6分钟；
③Landesberg法：2次离心，均用200g 10分钟；
④Aghaloo法：2次离心，215g 10分钟，863g 10分钟；
⑤程飚团队法：2次离心，377g 10分钟，1509g 20分钟。
不同的医生制备时所采用的方法不一样，但只要PRP中血小板计数高于自身全血血小板计数的3—5倍才是“浓缩血小板”，10ml血液可制备PRP1-1.5ml，故PRP的制备很大程度上取
夜尿停
决于医生的个人经验。
反渗透浓水PRP中加入的凝血酶等抗凝剂已被证实能够延缓伤口愈合，鉴于PRP的局限性，开发者Choukroun医生于2001年提出了第二代血小板浓缩物—PRF的概念，其目的是去除血小板制剂中抗凝剂的使用。PRF首次制备以来，研究人员不断对其常规制备方法进行改进，开发了多种PRF，如改良型PRF（A-PRF）、升级改良型PRF（A-PRF+）、注射型PRF（I-PRF）和钛制备型PRF（T-PRF）等。传统PRF的制备方法为用不含抗凝剂的玻璃或有玻璃涂层的塑料无菌采血管采血10ml，以2700rpm的速度快速离心12分钟，采血管中部凝块即为PRF，约2.5ml；I-PRF的制备为使用无涂层的无菌塑料采血管采血10ml，以700rpm的速度快速离心3分钟，分离的血浆和血小板形成浅黄的不透明层，位于管的顶部，约1-1.5ml，从抽取到注射时间不宜超过15分钟，以免I-PRF发生凝结。
Part 02
CGF的提出与发展
为了克服PRF应用形态单一、凝胶块体积较小、I-PRF提取量较少、无法真正实现注射操
作等不足，Sacco医生于2006年开发出了第三代血小板浓缩物—CGF，制备CGF需采用特制的不间断变速离心机，根据选用的采血管不同，CGF可制成液态CGF（LPCGF）、松散凝胶态CGF（LGPCGF）和凝胶态CGF（GPCGF），用于不同的临床需求。 Medifuge 200变速离心机（简称MF200变速离心机，下同）是由意大利Silfradent（赛法登特）公司所生产，查阅相关文献对该离心机的性能描述为：离心机具有独特的自动变速离心程序，除有特殊的不间断加速、减速全自动程序离心系统外，还具备精确的温控系统，离心系统内置自动通风温度控制设计，保持恒温15℃的低温环境，避免血液样本受到热损伤而变性失效。但从临床使用MF200离心机时发现其对温度控制系统方面的描述是欠严谨的，在使用中，我们发现离心腔内温度会由于离心次数增加导致的转子产热量增加而逐渐上升，测试过该离心机在连续工作后的离心腔内温度，最高可达42℃，对该离心机进行维养时发现，该离心机腔体底部并非是全封闭的，而是与外界环境相通，这也就不难理解其描述的自动通风系统，其实是通过离心时依靠转子的高速旋转带动气流与外界进行热交换，从而试图降低离心腔内温度，从基本的物理定律我们知道，这种自动通风系统所控制的温度并不是精确的，而是与外界环境温度密切相关。
半带滤波器正如MF200离心机对性能的描述中所称：保持恒温15℃的低温环境，避免血液样本受到热损伤而变性失效。但如果达不到真正的恒温低温环境，那就无法保证避免血液样本受到热损伤。另外，精确控制恒温低温环境在CGF的制备中还有一个极大的优势，那就是恒温低温环境制备LGPCGF时，LGPCGF可以保持40-50分钟的液态时间，这就给了临床医生充裕的时间来进行LGPCGF的注射操作，从而极大地拓展了LGPCGF的临床应用场景，而通过MF-200离心机制备LGPCGF，由于不能保持恒温低温环境，其保持液态的时间仅有5-10分钟左右，且随着离心腔内温度的升高LGPCGF保持液态的时间会越来越短暂，极大地限制了LGPCGF的临床应用场景。LGPCGF由于未添加任何抗凝剂，无需激活，这就有效避免了抗凝剂因降低凝血级联反应从而削弱CGF生物学活性的影响，也避免了抗凝剂可能给患者带来的过敏反应。
Part 03
唯蕊葆CGF离心机的优势
基于以上原因，为了优化CGF的临床应用，最大限度地发挥CGF的生物学活性效应，长沙唯蕊葆再生医学科技有限公司联合国内科研院所、业界专家、临床医生、离心机制造头部
企业、专用耗材生产商等优秀人才及企业，自2021年开始着手研发有自主知识产权的国产“唯蕊葆CGF离心机”，该离心机完全借鉴了国内外学术界公认的CGF标准离心参数及独特的自动变速离心程序，且进行了自主创新与升级，并申请了3项实用新型专利和2个注册商标等自主知识产权。
其主要特点：供氧器
1、温控系统采用压缩机制冷技术达到了精准温度控制，避免了血液样本的热损伤。
2、全封闭的离心腔，离心腔内置连续紫外线消毒系统，降低了污染和交叉感染的风险；
3、彩触屏开关控制，方便快捷，真正做到一键启动，自动完成CGF的离心过程。
4、温控系统及紫外线消毒系统可触屏启闭，从而延长了温控系统及紫外线消毒系统的使用寿命；
5、转子体与电机的自适应连接设计，极大方便了离心机腔内及转子的日常消毒与维养；
6、终身免费性能检测及规范化售后让离心机设备始终处于最佳状态，确保CGF制备时的
稳定性与可靠性。
自20世纪70年代在血小板分泌生长因子被发现之后，浓缩血小板制品便被逐渐越来越广泛地应用于临床修复、抗衰、活性再生等领域，但临床使用者在选择手工制备和机器设备等方式制备浓缩血小板制品时方法却千差万别,令人眼花缭乱，比如制备PRP、PRF时采用简单的检验用离心机，制备CGF时采用恒速离心机，按照CGF离心程序手动调节，或采用自编程序自动控制变速等。这些都不是标准的制备方法，通过非标方法制备出来的所谓PRP、I-PRF、CGF就是血浆，其中含有血小板、白细胞、电解质等，作用于机体也会产生一点生物学活性效应，但由于其含有的血小板、生长因子浓度不够，其发挥生物学活性作用的强度和持续时间是不确定的，临床效果势必大打折扣，这不是真正的EPT技术，而只能称之为血浆。浓缩血小板制品的制备方法中不可忽视的另一个重要因素就是离心设备，离心机质量对离心结果会产生重大影响。“MF200CGF离心机”和“唯蕊葆CGF离心机”都是严格采用离心机制造业公认的经典品牌“Intra-Spin离心机”标准，有研究显示在4个测试的离心机之间，在每个转速下的振动水平都有非常显著的差异。Intra-Spin是迄今为止所有配置中最稳定的机器，与其它3台经过测试的机器不同，它始终处于共振阈值以下，Intra-Spin的振动水平为其它离心机的16%-22%，意味着噪音最小，旋转时离心管的
温度最低，而其它产品管内温度均有显著升高。在这四种离心机中，Intrra-Spin产生的凝胶和渗出液量最大。而其它离心机产生的血块和膜要轻得多，而且更短和更窄。光学显微镜分析显示了所有凝胶类型具有相似的特征。然而，扫描电子显馓镜显示了样品之间的显著差异，Intrra-Spin制备的凝胶显示出高度聚合的厚纤维蛋白基质，所有细胞均以正常形状存活，包括活化淋巴细胞表面纹理，而其它品牌的凝胶样膜呈现出轻度聚合的纤细纤维蛋白凝胶，可见大多数细胞体存在压扁或收缩的情况，每个离心机都有自己清晰的振动曲线，而离心机的特性将直接影响凝胶的结构和细胞含量，这一结果提示了以往研究中存在的一个缺陷，即忽略了对离心机震动稳定性应做严格的质控。在制备过程中，相对离心力（RCF）和离心时间是决定提取物品质的关键。质量低劣的离心机上显示的离心力、转速数值误差较大，会直接影响所得浓缩血小板的质量，故选择合格的离心机非常重要，并不是所有的变速离心机都是CGF离心机！
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