质粒浓缩:Vml
①Vml 1×TAE防水伸缩缝或水②2V ml③混匀④离心,最大转速10min⑤取上清 ⑥1/10V ml NaAc(pH 5.2) ⑦4Vml 冰醋酸⑧置于-20℃,10min
批量控制器⑨离心,最大转速10~15min
10.弃上清
11.70%酒精洗两次(最大转速),酒精要吸干(离心两次,第一次倒干净,第二次空转吸净)
12.室温晾干
1. 加入 1/10 体积的乙酸钠(3 mol/L ,PH=5.2)于 DNA 溶液中充分混匀,使其 最终浓度为 0.3 mol/L;
2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于- 20℃中 15~30 分钟; 3. 12,000 g 离心 10 分钟,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴;
4. 加入 1/2 离心管容量的 70%乙醇,12000g 离心 2 分钟,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴; 档案管理方法5. 于室温下将开盖的 EP 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干;
6. 加适量的 ddH2O 泵头溶解 DNA 沉淀。
浓缩原理:
首先,向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc,混匀后,整个体系的Na+浓度就是0.3M(生理盐水的Na+浓度大约为0.15M)。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面,屏蔽掉模具特氟龙DNA链上PO4-的负电荷,有利于DNA链的压缩。否则的话,PO4-彼此排斥,DNA长效连续捕鼠器就不容易聚集。
接着,向整个体系添加2倍体积的无水乙醇。乙醇和水的互溶性很好,加进去后,乙醇
就把DNA表面的水膜夺走。换句话说,水和乙醇混去了,原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷,被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。
经过离心(12,000 rpm × 5 min),被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉,剩下DNA。然而,这时的DNA不纯,还混有酶切体系留下来的盐分,以及变性了的酶。酶变性了,量也不多,不用清除。
向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候,既有足够的乙醇保证DNA不溶于水,又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心,或者静置1分钟,来溶解盐分。然后,去干净上清,这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质,从而不会影响后续实验。
把沉淀烘干,最后用适量的水(或者TE溶液,tris保持弱碱性;EDTA螯合金属离子,抑制依赖于金属离子的DNAse;这样的DNA溶液质量更高)溶就可以了。