大肠杆菌感受态的制备
原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。
材料：
Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。 汽结构
LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP） 10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号头, 刻度移液管 均需灭菌处理
甘油：100ml (高压灭菌)
氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）： 1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。
仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。
步骤：1）从冻存的E.coli .Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不 含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。
2) 从新活化的E.coli .Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保存。
3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大 培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养.
摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。TB buffer置于冰上预冷(20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟)
以下步骤需在超净工作台和冰上操作；
5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。
6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。
备注:5)和6)是为浓缩细菌. 细菌置于 冰上,10min。
7）每管加1 ml 预冷的TB buffer，轻轻混匀，置冰上20~30分钟。
8) 3000 g 4℃离心5min,弃上清。
重复7)和8)
9）加入50 ul预冷的TB buffer，不要重悬或轻轻重悬，置4℃
10) (可 选)添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后, 超低温冷冻贮存备用（-70℃）
转化
1.50ul感受态+1ul质粒
2.冰浴30min。此时打开水浴锅预热。
3.42℃水浴90s,置于冰 上2分钟。
4.加1ml LB培养基（不用预冷、不含Amp）,混匀后转移到10ml圆底离心管中37℃震荡1h, 4000rpm 离心5 min,弃部分上清。
放血槽
5.铺板，将上述摇匀的菌液取20ul和100ul涂于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30min,待菌液完全吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。
6. 挑取一单菌落，菌落PCR鉴定正确。接种与2ml LB液体(含AMP)培养（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。提取质粒, PCR鉴定,酶切鉴定,测序鉴定。20%无菌甘油, －70℃保存。 LB液体培养基：
蛋白胨：1.0g
流感香囊Nacl: 3.0g
酵母粉：0.5 g
伸缩式雨棚用1N的NaOH调节PH=7，ddH2O:100ml
蓝盖瓶, 高压灭菌后使用，冷却至55℃左右加入Amp，常温备用。
LB固体培养基:
蛋白胨：1.0g
Nacl: 3.0g
酵母粉：0.5 g
琼脂糖: 1.5g
ddH2O:100ml
高压灭菌后，冷却至55℃左右加入Amp，铺板，倒置。先在常温下放置几小时-O/N. 4℃备用。
TB buffer
血竭提取物Hepes.Na:0.13g
无水CaCl2:0.083g
KCl:0.932g
Mncl2.4H2o:0.544g
dd H2o:50ml
先将前三者用超纯水溶解，用1N的Hcl调PH至6.7，不能调过，如果调过，需要重新配制。调好PH至6.7后，再加入Mncl2.4H2o溶解，最后定容至50ml。
>金属化膜
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