大肠杆菌菌种的制作及保藏
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用伊红美蓝培养基检测大肠杆菌。伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红，再与美蓝结合形成紫黑菌落，并带有金属光泽。从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。从而可从众多的菌落中把大肠杆菌选择出来。 2、保存原理：将大肠杆菌接种到固体培养基中放入较低的温度4℃的冰箱中进行保藏。可保存3到6个月，用来给学生做实验很方便。 二、实验材料
脂10g、乳糖 10g、蒸馏水500 ml、2%伊红水溶液 10ml、0.5 %美蓝水溶液 5ml 、1mol/l的NaOH、1mol/l的HCL。
2、实验器材：酒精灯、高压蒸气灭菌锅、培养皿、涂布器、锥形瓶、100ml烧杯、500ml烧杯、100ml锥形瓶、500ml锥形瓶、试管、无菌操作台、恒温培养箱。
微型直线电机三、实验步骤：
（一）制备培养基
1、培养基配制：
1）伊红美蓝培养基
①称量 蛋白胨 5g 氯化钠2.5g 琼脂10g
②溶化 往烧杯中加入称量好的蛋白胨、氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其溶化。溶解后用蒸馏水定容至500 ml，调节pH值为7.6。
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③灭菌电量控制 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋扎紧，再连同培养皿等一起放入高压灭菌锅，在压力为100KPa，温度为121℃条件下，灭菌15到30分钟。
④倒平板 冷却至60℃左右，再按基础培养基100 ml、20%乳糖 2ml 、2%伊红水溶液 2ml、0.5 %美蓝水溶液 1ml的比例，在无菌操作条件下加入灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液
及美蓝水溶液。摇匀后，立即倒平板。溶液中的乳糖高温下会破坏，因此一般使用压力为70KPa，温度为115℃的条件灭菌20min.
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2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏2.5g 蛋白胨 5g 氯化钠2.5g 琼脂10g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到500ml。
（二）分离纯化大肠杆菌
1．平板划线分离法：用接种环蘸下水道溶液或土壤浸出液 后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌就是由一个细菌产生的后代。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。
取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
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2．稀释涂布分离法：先将水道溶液或土壤浸出液稀释，通常稀释到104 ～106之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃器涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。
划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点,都可采用。
（三）菌落培养 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃的恒温箱中培养，培养12h和24h后，培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑，发金属光泽。分别观察并记录结果。
（四）纯化培养 将大肠杆菌菌落接种于试管斜面牛肉膏蛋白胨培养基上在合适的温度下培养，当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。
四、实验结果：
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