第33卷第5期2014年10月
中国野生植物资源Chinese Wild Plant Ｒesources Vol．33No．5Oct．2014 收稿日期：2014－04－12
基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项项目（2012YQ18013208）
作者简介：邢俊波（1971－），男，副主任药师，博士。研究方向：中药质量评价和新药研发。E- mail ：junboxing89@sina．com doi ：10．3969/j．issn．1006－9690．2014．05．006
邢俊波，曹
红，陈玉敏，水彩红，单婷婷，胡
丹，姜春来，靳守东
（中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京100071）
摘
要
目的：建立高效亲和谱法(HPAC )测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG 含量的方法。方法：采用
HI －Trap Protein G HP 亲和谱柱(1mL )谱柱，以0．05mol /L 磷酸盐缓冲液和0．05mol /L 的甘氨酸－盐酸缓冲
液为流动相，流速0．4mL ·min －1
，检测波长280nm ，柱温30ħ。结果：IgG 含量在0．1502 0．7512mg /mL 浓度范
围内与峰面积呈良好的线性关系(r =0．9999)；平均回收率为98．5%，ＲSD 为1．2%(n =6)。结论：方法简便、快速，重现性好。可作为牛初乳加钙咀嚼片的质量控制方法。关键词
牛初乳加钙咀嚼片；免疫球蛋白IgG ；高效亲和谱
中图分类号：TS252．1
文献标识码：A
文章编号：1006－9690（2014）05－0023－03
Determination of IgG in Bovine colostrum plus calcium
Chewable Tablet by HPAC
Xing Junbo ，Cao Hong ，Chen Yumin ，Shui Caihong ，Shan Tingting ，Hu Dan ，Jiang Chunlai ，Jin Shoudong （Institute for Drug and Instrument Control of Health Dept ，GLD of PLA ，Beijing 100071，China ）Abstract
Objective ：To establish a high performance affinity chromatography （HPAC ）method for de-termination of IgG in Bovine colostrum plus calcium Chewable Tablet ．Methods ：Chromatography was per-formed on HI-Trap Protein G HP affinity column．The 0．05mol /L PBS and 0．05mol /L glycin-hydrochlo-ric acid buffer solution was used as mobile phase．The flow rate was 0．4ml /min．Detective wavelength was 280nm．Ｒesults ：The calibration curves of IgG was linear within the range of 0．1502 0．7512mg /mL．The average recovery was 98．5%，and ＲSD was 1．2%（n =6）．Conclusion ：This method is sim-ple ，fast ，and reproducible．It can be used for the determination of the preparation including IgG．Key words
Bovine colostrum plus calcium Chewable Tablet ；IgG ；HPAC
免疫球蛋白在人体特异性免疫及抗感染过程中
起着重要作用，其抗感染能力与其在血清中的含量有直接关系。各种免疫球蛋白中IgG 含量最高，约占血清总免疫球蛋白的75% 80%。IgG 是血清和细胞外液中含量较高的免疫球蛋白，是再次免疫应答产生的主要抗体，能有效地预防相应的感染性疾病
［1］
。牛初乳加钙咀嚼片是以牛初乳粉和碳酸钙
等为主要原料制成的保健食品，富含免疫球蛋白IgG 、免疫促进剂等，从而增强儿童的自身免疫力，减少疾病感染机会，因此有必要对其主要功效成分IgG 含量进行测定，提高其质量可控性。目前IgG
检测方法主要有浊度法、免疫扩散法、紫外分光光度
法和酶联免疫法等［2－3］
，本文建立了采用高效亲和谱柱测定牛初乳加钙咀嚼片中IgG 的新方法。所
建方法简便、快捷，专属性好，可用于其质量控制。
1仪器与试药
高效液相谱仪：岛津LC －20AT 高效液相
谱仪，
SPD －20A 紫外检测器，LC －solution 谱工作站。甲醇为谱纯，水为重蒸水。免疫球蛋白IgG 对照品（CFAD －I5006，上海安谱科学仪器有限公司）。牛初乳加钙咀嚼片（1．2g /片ˑ60片，批号
—
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中国野生植物资源第33卷
为20120805、20120310、20130218，广东汤臣倍健生物科技股份有限公司）。
2方法与结果
2．1谱条件
谱柱：HI－Trap Protein G HP柱（1mL）；流动相A：pH6．5，0．05mol/L磷酸缓冲液，流动相B：pH2．5，0．05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液；检测波长：280nm；流速：1．0mL·min－1；柱温：40ħ。
表1谱条件
时间流动相A（%）流动相B（%）
0 4．51000
4．5 5．5100→00→100
5．5 15．00100
15．0 15．50→100100→0
15．5 22．01000
2．2系统适用性试验
按上述谱条件进样，得对照品、供试品及空白图谱，见图1，空白无干扰，理论板数按IgG峰计算可
达8000以上，且与相邻杂质峰的分离度均能达到要求。
2．3供试品溶液的制备
取本品细粉约0．2g，精密称定，置25mL量瓶中，用0．05mol/L磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，取上清液滤过，即得。
2．4对照品溶液的制备
取免疫球蛋白IgG对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液。
2．5阴性对照液的制备
按处方比例制备缺牛初乳的阴性样品，按含量测定方法操作，结果阴性样品在与免疫球蛋白IgG 对照品相同保留时间处，未显示谱峰。
2．6线性关系的考察
精密吸取免疫球蛋白IgG对照品溶液（1．878 mg·mL－1），0．4、0．6、0．8、1．0、2．0mL分别置于5 mL量瓶中，用0．05mol/L磷酸缓冲液定容，摇匀。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积
为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=62994．12X －1921．87，r=0．9999，线性范围为：0．1502 0.7512mg/mL。
2．7样品溶液稳定性试验
将待测样品溶液，在室温下贮存，每间隔一定时间进样测定，平均峰面积为210520，ＲSD为3．35%。
2．8重复性试验
电容式料位计
取同一批号的牛初乳加钙咀嚼片6份，按含量测定方法平行试验，测得平均含量为25．69mg·g－1，ＲSD为0．76%。510669
2．9准确度试验（加样回收率试验）
称取已知含量的同一批样品约0．10g（6份），精密称定，分别精密加入免疫球蛋白IgG对照品适量，按正文供试品溶液的制备方法操作，测定含量，并计算回收率，结果见表2。
表2加样回收率试验
称样量/g
相当免疫球蛋
金丝雀定位白IgG量/mg
加入量/mg实测量/mg回收率/%
平均回
收率/%
ＲSD/% 0．10252．63322．545．120497．92 0．10352．65892．545．184499．43 0．10622．72832．545．180696．5598．541．15 0．10282．64092．545．148298．71 0．10042．57932．545．103699．38 0．10362．66152．545．182599．25
2．10样品测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相谱仪，按上述谱条件，以外标法计算含量，结果3批制剂分别为25．69mg·g－1、25．62mg·g－1、25．85mg·g－1。谱图见图1
。
A．对照品B．样品C．阴性1．免疫球蛋白IgG
图1牛初乳加钙咀嚼片HPLC谱图
3讨论
高效液相亲和谱兼具亲和谱和高效液相
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人体3d建模
第5期邢俊波，等：高效亲和谱法测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量
谱的特点，是一种特异性较好的分离技术，其将配基键合在凝胶柱上，先用磷酸盐缓冲液平衡柱，当进样后，活性免疫球蛋白IgG在磷酸盐缓冲液中与配基连接并吸附在凝胶柱上，再用甘氨酸－盐酸盐缓冲液将其洗脱。一般分析时间短，效率较高，操作也较简便。
高效亲和柱介质为结合protein G的琼脂糖，耐受的pH值范围窄，并且残余硅羟基可造成非特异吸附而降低收率，甚至导致失活，因此流动相pH值的控制是影响分离的关键因素，通过比较不同pH 流动相
后，确定最适流动相为pH6．5的磷酸盐缓冲液与pH2．5的甘氨酸－盐酸盐缓冲液。另外从对照品图谱上可看出IgG主峰前有其它杂质峰，可能是制备时含有其他杂蛋白所致，但不影响测定结果。参考文献：
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