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H PLC-UV法检测芦荟、枸杞叶和桑叶中的褪黑素 赵建芬，杨海贵，李静仪
肇庆学院化学化工学院（肇庆 526061）
摘要建立提取和检测芦荟、枸杞叶和桑叶的中褪黑素的方法。以甲醇为提取剂, 采用超声波法提取褪黑素。谱柱为Agilent Eclipse XDB-C
18
(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相为无水甲醇-水 (50∶50, V/V ), 流速为1.0 mL/ min, 检测波长为222 nm, 柱温为室温。结果表明, 在所建立谱条件下, 褪黑素质量浓度在2.136×101~2.136×104 ng/mL范围内, 浓度和峰面积的线性关系良好 (R2=0.999 5), 最低检出限为0.2 ng。经测定芦荟中褪黑素含量为46.60 ng/g, 回收率为100.5%, RSD为1.2%; 枸杞叶中褪黑素含量为1.235×104 ng/g, 回收率为103.9%, RSD为1.2%; 桑叶中褪黑素含量为5.452×104 ng/g, 回收率为103.6%, RSD为1.9%。所建立HPLC-UV法简单易行, 检测速度快, 精密度、稳定性和准确度都令人满意。 关键词超声提取; 褪黑素; HPLC-UV分析
Detection and Quantification of Melatonin from Aloe vera, Medlar Leaves and
Mulberry Leaves by HPLC-UV
Zhao Jian-fen, Yang Hai-gui, Li Jing-yi
College of Chemistry and Chemical Engineering, Zhaoqing Univeristy (Zhaoqing 526061)
Abstract Establish the method on extracting and determining melatonin from Aloe vera, medlar leaves and mulberry leaves.
腰果去壳机Methanol as extraction agent, melatonin was extracted by ultrasonic method and then analyzed by HPLC-UV technique.
Chromatographic column was Eclipse XDB-C
18
(250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase was anhydrous methanol-water (50∶50, V/V); fl ow rate was
1.0 mL/min; detection wavelength was 222 nm; column temperature was room temperature. Results showed that under the chromatographic condition, linear relationship between peak and concentration over the range of 2.136×101~2.136×104 ng/mL (R2=0.999 5) was good, and the detection limit was 0.2 ng. The melatonin content of Aloe vera was 46.60 ng/g, and average recovery was 100.5% with a RSD of 1.2%. Melatonin form Medlar leaves was 1.235×104 ng/g, and average recovery was 103.9% with a RSD of 1.2%. Melatonin form Mulberry leaves was 5.452×104 ng/g, and average recovery was 103.6% with a RSD of 1.9%. This HPLC-UV method was simple, rapid, precision, stable, with satisfactory accurate.
Keywords ultrasonic extraction; melatonin; HPLC-UV analysis
褪黑素（melatonin，TM），又称褪黑激素，松果体素，是一种吲哚类胺（N-乙酰-5-甲氧基胺），化学结构式如图1所示。属于氨酸（Trp）衍生物。研究发现褪黑素具有镇静、调节睡眠、调节免疫系统、清除体内自由基、延缓衰老、抑制癌细胞的增殖等生物活性[1-4]。外服褪黑素在人体内执行内源性褪黑素相同的功能，可推断食物中的褪黑素可通过食用为人体所吸收利用[5]。因此，褪黑素正日益被开发应用于食品保健品上。褪黑素存在于动物、植物、藻类、真菌、细菌和原核生物中[6]，而且植物中几乎各种组织都含有褪黑素。目前对褪黑素的研究多集中于探讨其生理活性及药用价值[7-12]，关于植物褪黑素的提取和检测方法的研究却鲜有报道。
将采用甲醇超声波法提取芦荟、枸杞叶和桑叶等植物中的褪黑素，建立HPLC-UV（高效液相谱-紫外）法检测其含量。为新鲜植物中褪黑素的提取和含量检测方法的研究开发提供试验依据，为寻富含褪黑素的植物资源及其药用价值和营养价值的研究提供
有益的信息。
图1 褪黑素的分子结构式
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
芦荟，2012年冬季采摘于肇庆学院植物园；枸杞叶，2013年春季采摘于广州市小新塘农家；桑叶，2013年春季采摘于肇庆学院植物园。
丙酮（分析纯）：广州化学试剂厂；甲醇（谱纯）：天津市四友精细化学品有限公司；褪黑素标准品（纯度为98%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；屈臣氏蒸馏水。
Agilent 1200 高效液相谱仪：G1314B 型可变波长扫描紫外检测器：谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm 5-Micron，5 μm）；Agilent 谱工作站：美国Agilent 公司 ；AUY120 电子分析天平：日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制
称取褪黑素标准品0.010 9 g，置于5 mL的棕容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，经0.22 μm滤膜过滤，配成质量浓度约为2.136×106ng/mL的储备液，备用。
1.2.2 样品中褪黑素的提取[1, 13-15] 1.2.2.1 样品前处理
芦荟、枸杞叶和桑叶均于夜间采摘，以不透光纸包裹带回试验室。洗净后将其置于50 ℃以下烘干其表面水分。待其表面水分去除后，立即剪碎。
1.2.2.2 褪黑素提取
准确称取适量剪碎后的样品置于研钵中，并加入4.0 mL甲醇溶液、几滴丙酮溶液一同研碎样品；将其全部转移到一个烧杯中，800 W下超声提取30 min，全部转移至10 mL棕容量瓶中，用甲醇定容至刻度；再以4 000 r/min转速离心20 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，得到样品提取液，备用。每一样品平衡测定3次。
1.2.3 检测波长的选择
以甲醇溶液为参比，用紫外分光光度计在波长200~400 nm范围内对适当浓度褪黑素标准品溶液和样品溶液进行扫描，选择最佳吸收波长。
1.2.4 流动相的选择粽子机
甲醇和水按一定体积比混合为流动相，以流动相中甲醇和水的体积比为变量，用HPLC-UV法检测一定浓度的标品溶液和样品溶液，以峰形、分离度和检测时间等为指标来确定合适的甲醇-水比例。
1.2.5 谱条件
谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm 5-Micron，5 μm）；流动相为甲醇-水50∶50（V/ V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为222 nm；柱温为室温；进样量为20 μL进样分析。以保留时间定性，以峰面积定量。
1.2.6 方法学考察
1.2.6.1 线性关系的考察
取适量标准品贮备液，加入无水甲醇稀释使褪黑素标准溶液的质量浓度分别为2.136×101，2.136×102，4.272×102，2.136×103，1.068×104和2.136×104 ng/mL，在最优谱条件下，进样量为20 μL，每个浓度分别平行测定3次。以褪黑素标准溶液浓度为横坐标（X，ng/mL），平均峰面积为纵坐标（Y，mAU），绘制标准工作曲线，建立线性回归方程。
1.2.6.2 精密度试验
取2.136×103 ng/mL褪黑素标准溶液，在优化谱条件下连续测定6次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。
1.2.6.3 稳定性试验
取2.136×101 ng/mL褪黑素标准溶液，在优化谱条件下，分别于0，15，30，60和180 min进行测定，计算峰面积的RSD。
1.2.7 样品含量测定
在优化谱条件下测定各样品提取液，每一提取液分别连续进样3次，记录峰面积，分别计算样品中褪黑素的含量。
样品液中褪黑素质量浓度（X1，ng/mL）=（Y-69.143）/0.111 6 （1）
式中：Y-平均峰面积，mAU。
样品中褪黑素含量（X2，ng/g）=X1×10.0/m
（2）
式中：m-样品质量，g；10.0-样品稀释液总体积，mL。
1.2.8 加标回收试验
分别在样品提取液中加入低、中、高不同浓度的褪黑素标准溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复
进样3次，测定回收率和RSD。
回收率=×100%
x
red5集3
-x1
x
2（3）式中：x1-样品液中褪黑素含量/ng・mL-1；x2-加入量/ng・mL-1；x3-检测量/ng・mL-1。
2 结果与分析
2.1 检测波长的确定
通过对褪黑素标准溶液和样品溶液在紫外区的扫描，发现标品和样品在222，260和276 nm处均有较大吸收峰值，在222 nm处的吸收相对更强，而且标品峰和样品峰在此波长附近峰形相似度高，说明此波长处检测灵敏度高而且干扰少，所以，选择222 nm为检测波长。
2.2 流动相的确定
分别考察甲醇-水为40∶60，45∶55，50∶50，55∶45，60∶40和70∶30（V/V
）等比例时标品溶液
和样品溶液的峰形、分离度和检测时间等情况。结果发现，当甲醇-水为50∶50（V/V）时，目标峰峰形尖锐、对称，样品中目标峰与杂峰分离程度好，故选择甲醇-水比例为50∶50（V/V）作为流动相。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系的考察
褪黑素标准溶液的浓度和峰面积的关系如表1所示，计算得到回归方程为Y=0.111 6X+69.143（R2=0.999 5），表明褪黑素溶液在2.136×101~ 2.136×104 ng/mL质量浓度范围内，峰面积与浓度
的线性关系良好。
表1 褪黑素标准溶液的浓度和峰面积的关系
褪黑素标准溶液的质量浓度/ng・mL-1
2.136×1012.136×1024.272×1022.136×103 2.136×104峰面积/
mAU62.236 9283.740 20154.302 02287.358 782 455.629 23 2.3.2 精密度试验
如表2所示，平行测定质量浓度为2.136×103 ng/ mL褪黑素标准溶液6次，得RSD为2.5%，峰面积极差与算术平均值之比为2.6%，小于5.0%，符合国标GB/ T 5009.170—2003 中对精密度的要求，表明所建立的HPLC-UV法重现性良好，精密度高。
表2 精密度测定结果（n=6）
进样序号
123456
峰面积/mAU291.615 81287.635 52285.837 28286.335 51287.362 14284.125 03 RSD/% 2.5
2.3.3 稳定性试验
如表3所示，在避光条件下，3 h内，褪黑素峰面积的RSD为1.5%，表明所建立的检测方法具有良好的稳定性。
表3 稳定性测定结果
测试时间/min
led探照灯
0153060180
峰面积/mAU64.655 3162.845 7763.833 3263.235 2865.048 92 RSD/% 1.5
2.4 样品中褪黑素含量测定
通过保留时间和加标试验对芦荟、枸杞叶和桑叶等样品中褪黑素进行定性，如图2所示。样品谱图中有一些杂峰；但杂峰与目标峰分离度较好，不影响样品中的褪黑素含量的测定，故没有对提取液进行纯
化处理，避免在纯化过程中褪黑素的损失。
图2 标品和样品的谱图
各样品中褪黑素含量的测定结果如表4所示，其中新鲜芦荟里褪黑素的平均含量为46.60 ng/g，远低于文献[16]所报道的含量（516 ng/g），这与芦荟品种或测定组织不同有关。枸杞叶中褪黑素的平均含量为1.235×104 ng/g。目前有关检测枸杞叶中褪黑素含量的文献很少，Giuseppe Mazza等曾用HPLC-FD和MS 法检测枸杞种子中褪黑素的含量为103 ng/g[16]。桑叶中褪黑素的平均含量为5.455 2×104ng/g，高于文献[17]中报道的含量（1 510 ng/g）。这除了检测器及品种不同而引起的差异外，还与样品的处理方式不同有关。
不同样品测得的褪黑素含量有很大的差异，X.h u a n g a等曾报道番茄中的褪黑素含量高达221 900± 3 800 ng/g（HPLC-UV），而柠檬中却只检查到0.006±0.007 ng/g（HPLC-MS）[16]；同种样品的采集时间、采集季节、采集的地域、样品的前处理方法、提取方法（如提取的部位和干燥方法）与检测方法不同，其测量的含量也是有差别的，可见影响植物中褪黑素含量的因素有很多。
2.5 加标回收试验
在样品溶液中加入不同浓度的褪黑素标准溶液，测得各样品回收率和RSD如表5所示，平均回收率在100%~104%之间，RSD均小于2.5%，说明所建立HPLC-UV法可靠、不存在系统误差，可用于芦荟、枸杞叶和桑叶等植物中褪黑素的含量测定。
表5 样品回收率测定结果
样品x 1样品液中褪黑素含量/
ng・mL -1x 2加入量/ng・mL -1
x 3
检测量/
ng・mL -1
回收率/%平均回
基因测序仪收率/%RSD/%
芦荟
46.11
21.1567.36100.5100.5
1.2
41.8988.71
101.782.16
127.7299.3枸杞叶
506.08199.88710.93102.5103.9
1.2
395.84919.06104.3776.46
1 320.75104.9桑叶
2 467.97961.3
3 3 475.41104.8103.6
1.9
1 835.27 4 389.33104.7
2 556.52
5 059.39
101.4
3 结论
采用甲醇超声波法提取芦荟、枸杞叶和桑叶中褪
黑素，并建立HPLC-UV法测定其含量。所建立的方法线性关系良好，最低检测限为0.2 ng，低于国标GB/T 5009.170—2003 采用高效液相谱-紫外检测法检测保健食品中褪黑素含量的检出限（0.5 ng），平均回收率在100%～104%内，RSD均小于2.5%，具有良好的精密度和准确度，符合国标GB/T 5009.170—2003中对精密度的要求（在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%）。用该法测得芦荟中褪黑素含量为46.60 ng/g，枸杞叶中褪黑素含量为1.235×104 ng/g，桑叶中褪黑素含量为5.452×104 ng/g。所建立HPLC-UV法可靠、检测速度快，样品前处理简单，可推广应用于其他相关新鲜植物和食品保健中褪黑素含量的测定。值得注意的是，对于直接采摘的新鲜植物组织，因其本身的光合作用和自身代谢作用并未终止，对该类样品的分析要求制备的即时性；前处理时应尽量避免高温干燥，降低提取过程中褪黑素含量的损失，使结果更接近样品的实际含量。
参考文献：
[1] 王金英, 江川, 李书柯, 等. 褪黑素测定方法及玉米、水稻种子中褪黑素含量的分析研究[J]. 中国农学通报, 2009, 25(17): 20-24.
[2] 朱建军, 孙云汉. 褪黑素的合成及其生理和药理活性[J]. 国外医学药学分册, 1998, 25(5): 266-170.
[3] 徐峰, 李经才, 杨迎暴, 等. 褪黑素对光照制度改变影响的对抗作用[J]. 中国药理学通报, 1994, 10(6): 448-452.[4] 刘伟华, 张贵友, 戴尧仁. HPLC法测定黄芩叶、花、种子中褪黑激素的含量[J]. 植物学通报, 2003, 20(1): 75-79.[5] BURKHARDT S, TAN DX, MANCHESTER LC, et al. Detection and quantification of the antioxidant melatonin in Montmorency and Balaton tart cherries (Prunus cerasus ) [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4898-4902.
[6] R ÜDIGER HARDELAND, BURKHARD POEGGELER. Non-vertebrate melatonin[J]. Journal of Pineal Research, 2003, 34(4): 233-241.
[7] 张娜, 张海军, 杨荣超, 等. 褪黑素在植物中的功能研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28(09): 16-20.
[8] 陈会良, 顾有方, 李文超. 中草药褪黑素与抗氧化功能研究进展[J]. 中兽医医药杂志, 2007, 26(4): 21-23.
[9] 徐峰, 李经才. 褪黑素对睡眠的调节作用[J]. 国外医学精神病学分册,
1997, 24(2): 68-73.[10] 代国杰, 朱建津, 高琳琳, 等. 褪黑素对小鼠抗氧化作用的影响[J]. 食品工业科技, 2010, 31(3): 347-350.
[11] 刘淑英, 龄南. 褪黑素生理作用的研究进展[J]. 动物医学进展, 2005, 26(7): 11-14.
[12] 张红霞, 黄荣清, 肖炳坤, 等. 褪黑素在抑郁症中的研究[J]. 科学技术与工程, 2010, 10(1): 160-166.
[13] JAN KOL ÁŘ, IVANA MACH ÁČKOV Á. Melatonin in higher plants: occurrence and possible functions[J]. Journal of
表4 样品中褪黑素含量的测定结果
样品样品质量m/g
峰面积/mAU Y 平均峰面积/mAU X 1样品液中褪黑素质量浓度/ng・mL -1X 2样品中褪黑素
含量/ng・g -1
样品中褪黑素平均含量/ng・g -1
RSD/%
芦荟
10.000 271.994 9772.961 8578.167 6674.374 8246.8846.88
46.60
1.0
10.003 876.034 7474.436 0772.657 1174.375 9746.8946.8710.015 072.475 02
74.967 14
75.424 2974.288 8146.1146.04枸杞叶0.409 7129.492 94121.792 63
123.633 18124.972 95500.27 1.221×104 1.235×104
1.1
0.401 0120.294 04124.300 83130.511 24125.035 44500.83 1.249×1040.409 5125.679 05118.118 33
133.066 54125.621 34506.08 1.236×10
4
桑叶
0.454 0392.545 96319.879 94310.285 95340.903 95 2 435.13 5.364×104 5.452×104
1.6
0.452 4391.880 13315.902 34338.911 25348.897 90 2 506.76 5.541×1040.452 7328.571 90333.578 55
371.556 40
344.568 95
2 467.97
5.452×10
4
一种舟山海域海参（Pentacta inornata）营养成分
分析与评价
史青青，霍健聪*，俞晓雯，蔡林林
浙江海洋学院食品与医药学院（舟山 316000）
摘要研究了舟山海域产裸五角瓜参 (Acaudina molpadioides) 中主要营养成分。结果显示, 裸五角瓜参蛋白质含量较高, 粗蛋白含量达到16.43% (冻)、52.38% (干), 其中主要以胶原蛋白为主; 体内含有多种维生素, 以VE含量最为丰富, 达到221.2 mg/kg, 其余维生素含量较低; 矿物元素种类较多, 部分矿物元素如钾钠钙镁铁含量较高, 其中铁元素含量显著高于梅花参, 是贫血病人的良好补铁食物来源, 但铅和砷含量也较高, 且超过国家标准; 氨基酸评分标准结果表明裸五角瓜参蛋白质质量较低, 但由于含有丰富的呈味氨基酸, 表明其是一类生产海鲜调味料的良好原料; 裸五角瓜参中含有23种脂肪酸, 以单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸为主, 含量分别达到34.92%, 30.77%。舟山海域产裸五角瓜参是一种蛋白质、脂肪酸和矿物元素含量丰富的生物资源。
关键词舟山海域; 裸五角瓜参 (Acaudina molpadioides); 营养成分; 分析
Analysis and Evalution of the Nutritional Components of Sea Cucumber
(Pentacta inornata)
Shi Qing-qing, Huo Jian-cong*, Yu Xiao-wen, Cai Lin-lin
College of Food and medicine, Zhejiang Ocean University (Zhoushan 316000)
Abstract The main nutrient components of sea cucumber (Pentacta inornata) were tested and analyzed with routine methods. The results indicated that contents of crude protein of fresh meat and dry meat were 16.43 and 52.38, respectively, which mainly were collagen protein. The content of VE was 221.2 mg/100 g, with a comparatively low content of other vitamins. Moreover, there were abundant trace elements in sea cucumber, such as Ga, Mg, Na, K and Fe. The content of Fe was higher compared with Thelenota ananas. The content of total arsenic and lead were over standard in the meat of material. The result of AAS and CS showed that protein of Pentacta inornata was low, but because abundant amount of some taste amino acid, it was able to be the material for the production of sea sauce. There were 23 fatty acid, which were mainly composed by MUFA (34.92%) and PUFA (30.77%). In conclusion, sea cucumber (Pentacta inornata) is valuable marine biology resource with low fat, rich in collagen and trace elements.
Keywords Zhoushan marine; Acaudina molpadioides; nutritional components; analysis
海参（sea cucumber），属海参纲（Holothuroidea），是一种生活在海边到数千米深海的海洋棘皮动
物。长期以来我国对海参丰富的营养价值和鲜美口感推崇备至，将其列为“海八珍”之首。我国是海参生产大国，北至辽宁大连，南到南沙岛均有出产。从海参产地来分，我国海参主要有两大类：刺参和光参。刺参主要产于我国北方海域，肉质肥厚、味道鲜美，成为国内海参市场主要消费对象。由于刺参本身价格较高，加上近年来刺参养殖产业产量增加有限，造成了市场上对刺参的旺盛需求与刺参产量供给不足之间的矛盾，开发新的海参资源成为解决这一矛盾的主要出路。
Pineal Research, 2005, 39(4): 333-341.
[14] 王英娟, 步怀宇, 贾敬芬, 等. RP-HPLC法测定不同芦荟
中褪黑激素含量[J]. 食品科学, 200 8, 29(6): 350-352. [15] 王金英. 三种粮食作物高MT含量的种质资源及外源诱
导研究[D]. 福建: 福建农林大学, 2009.
[16] X IN HUA N GA, GIUSEPPE MAZZA. Application of LC
and LC-MS to the Analysis of Melatonin and Serotonin in Edible P l ants[J]. Food Science and Nutrition, 2011, 51(4): 269-284.
[17] CHEN GUOFANG, HUO YUSHU, TAN DUNXIAN,
et al. Melatonin in Chinese medicinal herbs[J]. Life Sciences, 2003, 73(1): 19-26.
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