一种脐带间充质干细胞增殖培养基及培养方法与流程

1.本发明涉及干细胞，尤其涉及一种脐带间充质干细胞增殖培养基及培养方法。

背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是目前最有前景的种子细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、增殖、多向分化能力的一类干细胞，mscs作为一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，因其具有自我更新复制和多向分化潜能，已被证明具有强大的修复再生损伤组织的能力。
3.骨髓间充质干细胞是最早发现的间充质干细胞，研究也最为广泛，但是成人骨髓间充质干细胞的数量、分化增殖能力受个体年龄、身体健康状态影响较大，且取样需要对骨髓进行穿刺，对身体伤害较大，操作过程也易受到污染。与骨髓间充质干细胞相比，来源于新生儿脐带的间充质干细胞属于医疗废物，取材方便，来源丰富，成本低，数量多且增殖分化能力强，能更好地应用于医疗和美容方面，是更理想的间充质细胞来源。
4.脐带间充质干细胞具有强大的增殖能力，可迅速扩增，还具有不易衰老、多向分化潜能等特点。为了保障脐带间充质干细胞的应用，通过体外增殖培养获得足够数量的细胞成为常用的技术手段。现有的脐带间充质干细胞培养基常添加动物血清等血液制品，增加了培养过程的不确定性和风险性，因此，有必要对脐带间充质干细胞的增殖培养基进行改进，提高培养基的安全性和脐带间充质干细胞在体外增殖的效率，在短时间内即可收获大量脐带间充质干细胞，降低脐带间充质干细胞的应用成本。

技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，成分安全，提高了脐带间充质干细胞的增殖速度和细胞活率，缩短贴壁时间，使脐带间充质干细胞的增殖效率更高，降低培养成本。
6.本发明的目的之二在于提供一种脐带间充质干细胞的培养方法。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
8.一种脐带间充质干细胞增殖培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素c。
9.进一步地，所述基础培养基为dmem低糖培养基，添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸3.5-6.5ng/ml、胡椒素4.2-7.4ng/ml、丝瓜络粉6.5-9.5ng/ml、谷胱甘肽10-15μg/ml、亚硒酸钠8.6-10.5ng/ml、表皮生长因子5-8ng/ml、维生素c1-4μg/ml。
10.进一步地，添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸5ng/ml、胡椒素6.4ng/ml、丝瓜络粉8.5ng/ml、谷胱甘肽12μg/ml、亚硒酸钠9.2ng/ml、表皮生长因子6ng/ml、维生素c3μg/ml。
11.进一步地，所述丝瓜络粉的细度为100-150目。所述丝瓜络粉的制备方法为：将丝瓜络清洗干净后在真空干燥箱中175℃条件下碳化处理5h，冷却至室温后进行粉碎，过筛得
到细度为100-150目的丝瓜络粉。
12.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
13.一种脐带间充质干细胞的培养方法，采用上述增殖培养基培养。
14.进一步地，脐带间充质干细胞在所述增殖培养基中的接种密度为1-5
×
104个/ml。
15.进一步地，在37℃，5％co2条件下进行细胞培养。
16.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，添加二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉等成分协同作用，无需添加动物血清，能有效提高脐带间充质干细胞的增殖速度，缩短贴壁时间，并且不改变细胞特性，经过短时间扩增后即能收获大量的脐带间充质干细胞，充分保障了脐带间充质干细胞在各个领域的应用。
17.本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的培养方法，采用本发明提供的增殖培养基，培养过程简便易于操作，有效降低脐带间充质干细胞体外培养的成本。
附图说明
18.图1为本发明实施例1，对比例1至5中脐带间充质干细胞的增殖曲线。
具体实施方式
19.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
20.实施例1
21.一种脐带间充质干细胞增殖培养基，由dmem低糖培养基和添加剂组成，添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素c；添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸5ng/ml、胡椒素6.4ng/ml、细度为100-150目丝瓜络粉8.5ng/ml、谷胱甘肽12μg/ml、亚硒酸钠9.2ng/ml、表皮生长因子6ng/ml、维生素c 3μg/ml。
22.一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下过程：取冻存1个月的处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞在37℃的水浴锅中快速复苏，离心去除冻存液，用pbs清洗细胞后加入上述增殖培养基重悬，调整细胞密度为3
×
104个/ml，接种在96孔板中在37℃，5％co2的培养箱中进行培养，每3天换液一次，连续培养7天。
23.实施例2
24.一种脐带间充质干细胞增殖培养基，由dmem低糖培养基和添加剂组成，添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素c；添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸3.5ng/ml、胡椒素4.2ng/ml、细度为100-150目丝瓜络粉6.5ng/ml、谷胱甘肽10μg/ml、亚硒酸钠8.6ng/ml、表皮生长因子5ng/ml、维生素c1μg/ml。
25.一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下过程：取冻存1个月的处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞在37℃的水浴锅中快速复苏，离心去除冻存液，用pbs清洗细胞后加入上述增殖培养基重悬，调整细胞密度为1
×
104个/ml，接种在6孔板中在37℃，5％co2的培养箱中进行培养，每3天换液一次，连续培养7天。
26.实施例3
27.一种脐带间充质干细胞增殖培养基，由dmem低糖培养基和添加剂组成，添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素c；添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸6.5ng/ml、胡椒素7.4ng/ml、细度为100-150目丝瓜络粉9.5ng/ml、谷胱甘肽15μg/ml、亚硒酸钠10.5ng/ml、表皮生长因子8ng/ml、维生素c 4μg/ml。
28.一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下过程：取冻存1个月的处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞在37℃的水浴锅中快速复苏，离心去除冻存液，用pbs清洗细胞后加入上述增殖培养基重悬，调整细胞密度为5
×
104个/ml，接种在12孔板中在37℃，5％co2的培养箱中进行培养，每3天换液一次，连续培养7天。
29.对比例1
30.对比例1提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，和实施例1的区别为：省去胡椒素，其余均和实施例1相同。
31.对比例2
32.对比例2提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，和实施例1的区别为：省去胡椒素，将二十碳五烯酸的用量调整为11.4ng/ml，将其余均和实施例1相同。
33.对比例3
34.对比例3提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，和实施例1的区别为：省去二十碳五烯酸，将其余均和实施例1相同。
35.对比例4
36.对比例4提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，和实施例1的区别为：省去二十碳五烯酸，将胡椒素的用量调整为11.4ng/ml，将其余均和实施例1相同。
37.对比例5
38.对比例5提供一种脐带间充质干细胞增殖培养基，和实施例1的区别为：省去丝瓜络粉，其余均和实施例1相同。
39.自脐带间充质干细胞接种后的第二天开始检测od值，检测方法为：每孔加入100μl cck-8，继续培养2h，采用酶标仪检测在450nm处的吸光值(od值)，每次均取6孔的平均值，连续检测至第7d，绘制细胞的生长曲线，结果如图1所示。对培养至第7d的细胞取样，采用0.4％台盼蓝染，计算细胞活率，结果如表1所示。
40.表1
41.组别实施例1对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5细胞活率(％)99.0691.4792.3594.2789.4287.63
42.由图1可以看出，实施例1中培养的脐带间充质干细胞增殖速度较快，明显高于对比例1至5。对比例1至5中调整了培养基的组成。对比例1中省去了胡椒素，从细胞增殖曲线可以看出，细胞的生长速度下降不及实施例1。对比例2中在省去胡椒素后增加了二十碳五烯酸的用量，从细胞的增殖曲线可以看出，对比例2中脐带间充质干细胞的增殖速度高于对比例1，但是仍不及实施例1。对比例3中省去了二十碳五烯酸，对比例4中在省去了二十碳五烯酸后增加了胡椒素的用量，由图1可知脐带间充质干细胞的增殖速度均不及实施例1。说明本发明培养基中添加的二十碳五烯酸和胡椒素协同作用，促进脐带间充质干细胞的增
殖。对比例5中省去了丝瓜络粉，也在一定程度上影响了脐带间充质干细胞的增殖速度，说明丝瓜络粉的添加进一步促进了脐带间充质干细胞的增殖，提高细胞增殖速度，经过短时间的体外培养即可收获大量的细胞。
43.由表1可以看出实施例1中脐带间充质干细胞的活率较高，对比例1至5中细胞活率均有不同程度的下降，对比例1至5中调整了培养基的组成。说明本发明培养基中的二十碳五烯酸、胡椒素和丝瓜络粉还有助于脐带间充质干细胞保持活性，减少脐带间充质干细胞凋亡。
44.在倒置显微镜下分别观察统计实施例1至3，对比例1至5中脐带间充质干细胞的贴壁时间，结果如表2所示。
45.表2
[0046][0047]
由表2可以看出，实施例1至3中的细胞贴壁时间在48-49h，对比例1至4中的贴壁时间在50-51h，和实施例1相比相差不是太大。对比例5中的贴壁时间为67h，和实施例1相比细胞贴壁用时较久。对比例1至4中调整了二十碳五烯酸、胡椒素及其用量，对比例5中省去了丝瓜络粉，说明丝瓜络粉对脐带间充质干细胞贴壁性能的影响较大，添加丝瓜络粉有助于缩短脐带间充质干细胞的贴壁时间，提高细胞的增殖特性。
[0048]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：

1.一种脐带间充质干细胞增殖培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素c。2.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞增殖培养基，其特征在于，所述基础培养基为dmem低糖培养基，添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸3.5-6.5ng/ml、胡椒素4.2-7.4ng/ml、丝瓜络粉6.5-9.5ng/ml、谷胱甘肽10-15μg/ml、亚硒酸钠8.6-10.5ng/ml、表皮生长因子5-8ng/ml、维生素c1-4μg/ml。3.根据权利要求2所述脐带间充质干细胞增殖培养基，其特征在于，添加剂中各组分在培养基中的质量浓度为：二十碳五烯酸5ng/ml、胡椒素6.4ng/ml、丝瓜络粉8.5ng/ml、谷胱甘肽12μg/ml、亚硒酸钠9.2ng/ml、表皮生长因子6ng/ml、维生素c3μg/ml。4.根据权利要求2所述脐带间充质干细胞增殖培养基，其特征在于，所述丝瓜络粉的细度为100-150目。5.一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述增殖培养基培养。6.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，脐带间充质干细胞在所述增殖培养基中的接种密度为1-5
×
104个/ml。7.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在37℃，5％co2条件下进行细胞培养。

技术总结

本发明公开了一种脐带间充质干细胞增殖培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的组成为：二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉、谷胱甘肽、亚硒酸钠、表皮生长因子、维生素C。本发明提供的增殖培养基添加二十碳五烯酸、胡椒素、丝瓜络粉等成分协同作用，无需添加动物血清，能有效提高脐带间充质干细胞的增殖速度，缩短贴壁时间，并且不改变细胞特性，经过短时间扩增后即能收获大量的脐带间充质干细胞，充分保障了脐带间充质干细胞在各个领域的应用。本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的培养方法，采用本发明提供的增殖培养基，培养过程简便易于操作，有效降低脐带间充质干细胞体外培养的成本。培养的成本。培养的成本。