QuantiGene Plex 2.0的详细操作流程（抽滤法）此流程除了洗脱步骤，其他步骤也适用于磁珠洗板机洗脱法，使用的是Panomics公司的试剂。
操作流程简介：
1.目标RNA的释放
2.目标RNA的捕获
3.信号放大
4.检测
以下将针对上述四大流程进行详细的说明。
目标RNA的释放：
此步流程即为组织细胞匀浆液的制备，鉴于本实验室所处理样本的类型，下面只介绍用RNAlater保存的样本和石蜡包埋切片处理样本的组织细胞匀浆液制备方法。 实验开始之前，用RNase Zap处理所有物品的表面。
保存于RNAlater中的组织其细胞匀浆液的制备方法
此步骤不适用于下列类型的样本：
●骨
●肌肉
●胰腺
●胃
●空肠
准备步骤：
1.将新鲜组织放于5倍体积的RNAlater中，4℃孵化16-18小时。
2.准备适量的匀浆溶液，每5mg组织
●300μl匀浆溶液
●3μl 蛋白酶K
漩涡震荡混匀
3.用吸水纸将附在组织上的RNAlater吸除干净。
4.组织匀浆液的制备。
a.将组织和匀浆溶液转移到Dounce组织研磨器中，加入4-6颗不锈钢珠和适量玻璃砂， 匀浆直至无可见的颗粒。
b.将匀浆液转移至离心管中。
5.65℃孵化匀浆样品30min，在此过程中每隔10min最高速漩涡震荡1min。
注意：有些组织如连接组织需要更长的孵化时间（最长18h）来减少粘稠性。
6.16,000×g离心样品15min，沉淀细胞碎片，将上清液转移到新的离心管中，重复此步骤
一次。
7.立即使用组织匀浆液或保存于-80℃冰箱中。
石蜡包埋切片组织匀浆液的制备
1.测量和转移组织。
a.测量长(L)和宽(W)，计算面积(L×W)mm2
b.用干净的刮刀将FFPE样品完全刮入1.5ml离心管中，避免刮入过多的石蜡。
注意：要保证足量的相当于50-60μm厚的组织样本，如果样本厚度为10μm，则放5-6片于一个离心管中。
2.溶解组织。
a.根据下表中的体积来加入匀浆液和蛋白酶K
对于总厚度为50-60μm厚的组织片
b.65℃孵化样本6小时。短暂地漩涡震荡样本，每过1小时漩涡震荡1min。
3.室温下最大速度离心样品5min，沉淀细胞碎片，然后将匀浆液转移至新的离心管中，
避免石蜡和碎片残留，如有必要重复操作来去掉碎片。
注意：在室温下离心会使残留的石蜡固化，在匀浆液表面会形成固态的石蜡残留。用移液管刺穿石蜡层吸取匀浆液转移。
4.立即使用组织匀浆液或保存于-80℃冰箱中。
目标RNA的捕获
Day1
自制cd架
1.准备下列试剂
●Probe Set 和Blocking Reagent，融化，短暂漩涡震荡混匀，短暂离心，收集管底部
的物质。
●Capture Beads，用之前从贮藏处取出，避光。
●Proteinase K，用之前从贮藏处取出，置于冰上。
●组织匀浆液，如果是冷冻的，室温下融化，37℃孵化30min。对于管子，短暂漩涡
震荡，对于板子，上下吹打5次，然后放置在室温下。燃烧匙
注意：不要把样本重新放回冰上。
2.Lysis Mixture 在37℃下预暖30min，再轻柔地震荡。
3.用匀浆溶液恰当地稀释组织匀浆液，使样品的需要量为每孔40μl，要确保实验信号在仪
器所能检测的范围内和实验线性范围内。
4.通过结合下表中所列的试剂准备适量的Working Bead Mix。城市垃圾处理
注意：在加入之前漩涡震荡（最高速）Capture Beads 30sec。
5.漩涡震荡Working Bead Mix 30sec，分别加入Hybridization Plate中，少于48个孔使用单
管道移液器，每次转移都要更换一次新头，每孔中加入60μl Working Bead Mix。
多于48个孔：
A.用单管道移液器，将Working Bead Mix 转移到25ml试剂储藏池中。
注意：不要倾倒，否则试剂将会出现损耗。
B.使用排，每次转移都要更换一次新头，每孔中加入60μl Working Bead Mix。
注意：包括3个孔的实验背景对照
6.加入40μl的组织匀浆液到含有Working Bead Mix的Hybridization Plate中。
注意：加入40μl的匀浆溶剂到作为背景实验的3个孔中。
7.用压力封板膜密封Hybridization Plate。
A.将压力封板膜放于Hybridization Plate中间。
B.用软橡胶滚压器，平衡地滚压封板膜。
8.将Hybridization Plate置于Shaking incubator中。
54℃±1℃孵化18-22小时，600rpm
信号放大
Day 2
实验开始之前：
将Amplifier Diluent, Label Probe Diluent, SAPE Diluent放于室温下。使Amplifer Diluent 37℃温暖20min，溶解沉淀，颠倒混匀。
准备Wash Buffer：
1.加入1个250ml的量筒中，按下列顺序
●150ml双蒸水(ddH2O)
●0.6ml Wash Buffer Component 1中草药压片机
●10ml Wash Buffer Componet 2
用ddH2O将体积补足到200ml
注意：每块板准备200ml Wash Buffer
2.转移到250ml的容量瓶中，来回颠倒混匀。
Wash Buffer 现用现制。
生产H
重要的预防措施：
●避免用手指或台面接触过滤板的底部。
●避免每个孔中的溶液溅出，交叉污染。
●在抽滤时，真空压力不要超过1-2英寸汞，否则Capture Bead将会丢失。
●检查过滤板底部是否有裂痕，不要使用破裂的板。
一个圆柱形玻璃容器●不要让Filter Plate在空气中干燥，当抽滤结束时，立刻关上真空抽滤装置，加入后
续溶液。
●不要压Filter Plate的顶部，以免造成试剂的损失。
●尽量减少珠子暴露在室温下的时间。
杂交2.0 Pre-Amplifier:
1.准备
2.0 Pre-Amplifier Working Reagent
A.简短离心2.0 Pre-Amplifier，收集管子底部的物质。
B.将36μl 2.0 Pre-Amplifier加入12ml的Amplifier Diluent中。
C.来回颠倒数次。
注意：Amplifier Diluent 是一种粘性溶液，小心吸取保证所有的物质从移液管中排出，Working Reagent 完全转移到reagent reservoir中。
2.预湿过滤板
A.将Wash Buffer装入100ml reagent reservoir中。
B.用铝箔将不用的孔密封起来。
C.将Filter Plate置于Filter Plate Holder上。
D.Filter Plate每个孔中加入100μl的Wash Buffer，室温下孵化1min。
E.将Filter Plate转移到vacuum manifold上，过滤掉Wash Buffer。
注意：确保真空过滤器的压力不超过Hg的1-2 inches，抽滤时间是5-15s，必要时调整压力。
F.关掉真空抽滤器，将Filter Plate放回Filter Plate Holder上。
3.将过夜杂交的混合物转移至Filter Plate中。
A.将Hybridization Plate 从shaking incubator 中取出，240×g室温离心1min。
注意：调整shaking incubator的温度50℃±1℃。
B.上下吹打5次，完全将过夜杂交的混合物转移到Filter Plate中。
C.将Filter Plate 转移到vaccum manifold and filter上，完全过滤。
D.立刻进行后续操作。
4.洗掉未结合的样本
A.小心地向每个孔中加入200μl的Wash Buffer，完全过滤，将真空抽滤器关掉。
B.重复上述步骤两次，一共洗三次。
C.用吸水纸吸一下Filter Plate的顶部和底部，去掉残留的Wash Buffer，将它放回Filter
Plate Holder上。
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