【目的】疾病的预防与控制是确保人和动物健康的关键。 病毒性传染病的记 载已有数千年 , 严重危害人类和动物的生存与健康。 分离和鉴定病毒以及确定病毒与疾病和宿主的关系是预防、 诊断和病毒 性传染病的首要任务。下一代测序（NGS技术以高通量、低成本和快速为主要特 征,克服了传统技术方法的局限性并满足大规模测序任务的要求 , 是目前快速鉴 定和发现未知病原体的最高效而准确的技术。
RNA病毒的快速检测，对于诊断、、控制和预防由 RNA病毒引起人和动 物的感染性疾病至关重要。近年来,下一代测序技术的发展，创新了 RNA病毒检测 方法。
NG刖以通过一些随机模式揭示标本内大量的核酸序列 （DNA或 RNA）,并可同 时检测各种RNA病毒。这些RNA病毒基因组的检测，不仅广泛应用于感染性疾病 的诊断,还广泛应用于新型病毒的鉴定和宿主与病毒关系的研究。
在使用NGS技术进行测序之前,RNA必须被逆转录,由于临床标本中的病毒 RNA数量有限、容
易发生降解,因此制备有效的测序文库仍然是基于 耳塞棉NG战术检 测RNA病毒基因组的关键，但其方法仍然复杂，需要进一步优化。为了更好地鉴定 RNA病毒,本研究尝试设计一种操作简便、测序结果更为理想、花费更少的 RNA
病毒测序文库制备方法。
为RNA病毒基因组下一代测序文库的构建方法提供数据和参考。 【方法】首
先是设计用于检测RNA病毒基因组的下一代测序文库制备方法。
方法1是商业化试剂盒法 ,根据制造商的说明书进行的。 简言之,定量提取的 病毒RNA然后使用RNase III舵角指示器消化
将片段化的RNA与随机接头连接,然后进行逆转录。通过PCRT增c DNA最
后收集约 450bp 大小的文库扩增子。
方法2是自行发明的,以随机RT反应开始,合成第一链后使用RNase H特异 性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA再合成第二链c DNA并进行PCRT增,最后收 集约450bp大小的文库扩
增子。方法3是从一个序列非依赖性单引物扩增(SISPA) 方法的基础上改进的。
简言之,使用随机引物SPN8逆转录提取的病毒RNA然后将RT体系变性。使 用变性的RT体系修饰第二链c DNA合成后，使用引物SP进行PCR
将PCF扩增产物剪切,然后连接测序接头。最后，收集约粉末冶金轴承450bp大小的连接产 物并扩增。
新方法设计成功后 , 使用三种方法分别对已知样品制备文库。所有文库均使 用相同的测序试剂分别在 Ion 318?芯片上,通过 Ion Torrent PGM 平台测序。
将测序所得 reads 和 contigs 的数量和种类、测序深度及平均覆盖率等方面 分析, 比较三种方法的优缺点。 最后采集临床样品 , 用三种方法分别建库测序来验 证各个方法在病毒鉴定和特性分析等方面的特点。
【结果】本论文主要研究内容和结果如下:(一)RNA病毒基因组下一代测序 文库的构建使用三种方法分别制备 RNA病毒基因组的下一代测序文库。其中，方 法1中,测序引物通过随机杂交引入 ,并使用 Ion Total RNA-Seq v2 连接到片段 化的病毒 RNA。
方法2是自行设计的,其原理是通过随机逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR) 构建文库。另外 ,方法 3使用单一引物通过杂交并连接到片段化的随机 RT-PCR
扩增，该方法是我们借助序列非依赖性单引物扩增(SISPA)法原理修饰改进的
本研究中,通过对采集的临床样品进行PCR佥测,筛选其中含有特异性
AIV,NDV和IBV的样品作为模拟样品同时建库测序来检验方法 2和方法3的可行 性,并对三种方法进行比较。实验过程发现,方法1中使用RNaseffl使RNA片段化 的过程难以确定酶切时间 , 并且对文库质量难以控制。
研究发现,三种方法均检测到AIV和NDV而只有方法3可检测到IBV。方法 2和3在被用于制备检测RNA病毒基因组的测序文库方面可能优于方法 1。
从测序深度和测序覆盖率分析表可以看出 , 方法 2 和方法 3 在测序深度和测 序覆盖率方面优于方法 录入笔1, 其中在方法 3比方法 2在测序覆盖率上更有优势。 （二） 病毒宏基因组学分析鸭子粪便样本中的病毒本研究中 , 收集活禽市场鸭子的粪便 样品制成的混合样品，采用三种RNA病毒基因组下一代测序文库制备方法分别建 库测序并对结果进行分析比较。
研究发现,方法2和3在被用于制备检测RNA病毒基因组的测序文库方面可 能优于方法1。方法1在低大蒜剥皮机RNA浓度样品情况下检测和鉴定 RNA病毒没有优势。
方法 2和方法 3可以检测到较多的病毒科和病毒属 ,而且方法 2更有优势。 另外, 分析病毒时 , 为确保大多数 hits 是可靠的 , 我们手动检查了所有 843个不包 含噬菌体的病毒 ,发现所有病毒 hits 有 30个例外的病毒 hits 。
通过分析病毒宿主 , 我们发现鸭子生活环境和饮食中存在的一些病毒 ,为鸭 子潜在疾病的预防、 饮食卫生和环境的杀菌消毒等提供理论指导。 （三）病毒宏基 因组学分析水貂粪便样本中的病毒本研究中 , 从水貂养殖场收集水貂粪便样品制 成的混合样品，采用三种RNAW毒基因组下一代测序文库制备方法分别建库测序 并对结果进行分析比较。
研究发现, 方法 2和方法 3可以检测到较多的病毒科和病毒属 ,而且方法 2 获得最多的病毒 contigs 。手动检查了所有 3534个不包含噬菌体的病毒 , 发现所 有病毒 hits 有 10 个例外的病毒 hits 。
水貂冠状病毒株 WD112和WD1133测序覆盖率分析,方法2和方法3均优于 方法1,而且方法2
测序WD112毒株有优势、方法3测序WD113毒株有优势。 分析病毒宿主和来源 , 我们发现了一些重要的水貂病毒数据和多个病毒可能是通 过本研究首次在水貂报道的 , 为水貂病毒的检测和预警提供理论参考。
【结论】综上所述，本研究建立了可靠的RNA病毒基因组下一代测序文库制 备方法 , 并且应用这些方法分别对含有已知病毒 AIV、 NDV、 IBV 的模拟样品中 , 新鲜采集的鸭子粪便和水貂粪便混合样品建库测序。通过上述研究 , 我们发现方 法 2 和方法 3 比方法 1 可以获得更多的映射到病毒的 定向扬声器contigs, 而且可以鉴定更 多的病毒科和病毒属。
方法 3 在测序深度和覆盖率分析中似乎是最好的。 因为方法 1 和方法 3 都需 要用于核酸片段化和测序接头连接的特定商业化试剂盒 , 所以比不需要任何试剂 盒的方法 2 费用更加昂贵。
从操作难易程度上讲 , 方法 2 和方法 3操作简便耗时较短 , 而且易于控制建库 质量,其中方法2更具优势。这项研究对于选择合适的方法来制备用于 RNA病毒 的病毒检测的测序文库是重要的。
它还产生了关于鸭和水貂的一些重要的病毒学数据 , 并且多种水貂病毒属可 能是通过本研究首次报道
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议