生物化学（上）实验
一、实验目的：
1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；
2、掌握影响分配系数的因素。
3、学会分析未知样品的氨基酸成分。
二、原理
滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：
Rf ＝原点到层析斑点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离
物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸（5）小型玻璃喷雾器（6）铅笔、直尺等。3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨酸标准品。（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.25%的水合茚三酮溶液。 四、实验步骤：
1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中。
2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。
3、点样：用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。4、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50－60ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。5、显：用喷雾器将0.25％茚三酮显剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显。 五、实验结果与计算：
1、用铅笔将层析谱轮廓和中心点描出来；
2太阳能淋浴器、测量原点至谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸谱的Rf值。
3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。
六、注意事项
1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套。
2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显则要用热风吹干滤纸。
七、思考题
1、如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？
2、纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？
实验目的
1、加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识
2、掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理
一、蛋白质呈反应
蛋白质的呈反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有物质的反应。
（一）双缩脲反应
1、实验原理
双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜反应。一般分子中含有
两个氨基甲酪基(即肽键：-CO-NH-)的化合物与碱性铜溶液作用，形成紫或蓝紫复合物，利用这个反应借助分光光度计可以测定蛋白质的含量。
双缩脲试剂有NaOH和CuSO4配制而成，必须当场配制当场使用。
2、试剂
蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层纱布滤去不溶物）
0.1%的甘氨酸溶液
0.01%精氨酸溶液
10%NaOH溶液
1%CuSO4溶液
3、实验操作及观察现象
取试管4支，按照下表加入各种试剂，观察现象
试剂 | 管号 |
1 | 2 | 3 | 4 |
蛋白质样（ml） | | 1.0 | | |
0.01%精氨酸（ml） | | | 1.0 | |
0.1%甘氨酸（ml） | | | | 1.0 |
10%NaOH（ml） | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
蒸馏水（ml） | 1.0 | | | |
1%硫酸铜溶液(滴) | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
现象 | | | | |
| | | | |
（二）茚三酮反应
1、实验原理
在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫缩合物。此反应为一切蛋白质和α升降柱cncame—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄化合物),含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。
2、试剂
蛋白质样液（与双缩脲反应相同）
0.1%的甘氨酸溶液
0.2%茚三酮溶液
3、实验方法
取试管2支，分别加入蛋白质样液及0．1％甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液0.5ml，混匀后于沸水浴中加热数分钟，观察现象。
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析作用
1、实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐。蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。
2、试剂
.鸡蛋清的氯化钠溶液（一分鸡蛋清加10份0.9%氯化钠溶液）HOST 格式
固体硫酸铵
3、实验操作
取鸡蛋清氯化钠溶液约2ml于试管中，加入硫酸铵粉末，注意不要加到壁上，至硫酸铵饱和不再溶解为止，边加边振摇，此时溶液颜为乳白，说明原因。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
1、实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如陶瓷灯头Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。
2、试剂
蛋白质样液（与双缩脲反应相同）
5% CuSO4溶液
3%AgNO3
3、实验操作
取试管2支各加蛋白质溶液1ml，向各管分别滴加2-3滴加5％CuS04溶沼气发酵罐 液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。说明原因。
（三）有机酸沉淀蛋白质
1、实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、和磷钨酸等。当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质，为首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。
2、试剂
蛋白质样液（与双缩脲反应相同）
10%三氯醋酸溶液
20% 5-浅卡磺基水杨酸溶液
3、实验操作
（1）取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴三氯 醋酸溶液，观察现象并说明原因。
（2）取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴水杨 磺酸溶液，观察现象并说明原因。
实验三、糖的性质
一、实验目的
1. 验证和巩固糖类物质的主要化学性质。
2. 熟悉糖类物质的某些鉴定方法。
二、仪器与药品
恒温水浴锅；
5%葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉液；
间苯二酚；
Benedict试剂（配方：①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；②50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜。制成CuSO4溶液； ③把CuSO4溶液倒入柠檬酸钠溶液-Na2CO3中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。）；
Fehling试剂（甲液 氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液。 乙液 硫酸铜的质量分数为0.05 g/mL的溶液。 使用时，将4～5滴乙液滴入2 mL甲液中，混合后立即使用。）；
浓盐酸、10%NaOH；
I2-KI（碘1g+碘化钾2g+蒸馏水300ml或95%乙醇300ml）、
三、实验步骤
1、 间苯二酚试验
在试管中加入间苯二酚2ml，加入5%葡萄糖溶液1ml，混匀，沸水浴中加热1-2min，观察颜有何变化？加热20min后，再观察，并解释。
试样：5%葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖
2、 Benedict试剂、Fehling试剂检出还原糖
（1）与Benedict试剂反应：取6支试管分别加入1ml Benedict试剂，微热至沸，分别加入5%葡萄糖溶液，在沸水中加热2-3min，放冷观察现象。
试样：5%葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉
（2）与Fehling试剂反应：取6支洁净的试管分别加入1.5mlFehling试剂，分别加入0.5ml5%葡萄糖溶液，在60-800C热水浴中加热，观察并比较结果，解释为什么？
试样：5%葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉液、滤纸浆
3、糖类物质的水解
（1）蔗糖的水解：取1支试管加入8ml5%蔗糖并滴加2滴浓盐酸，煮沸3-5min，冷却后，用10%NaOH中和，用此水解液作Benedict试验。
（2）淀粉水解和碘试验
①2%淀粉溶液的配制。
②碘试验：向1ml淀粉溶液中加入9ml水，充分混和，向此稀溶液中加入2滴碘-碘化钾溶液，将其溶液稀释，至蓝液很浅，加热，结果如何？放冷后，蓝是否再现，试解释之。
③淀粉用酸水解：在100ml小烧杯中，加30ml胶淀粉液，加入4-5滴浓盐酸，水浴加热，每隔5min从小烧杯中取少量液体做碘试验，直至不发生碘反应为止，先用10% NaOH中和，再用Fehling试剂试验，观察，并解释之。
④淀粉用酶水解：在一洁净的100ml三角烧瓶中，加入30ml胶淀粉，加入1-2ml唾液充分混合，在38-400C水浴加热10min，将其水溶液用Benedict试剂检验，有何现象？并解释。
实验四、酪蛋白的制备
一、目的
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜牛奶
（二）试剂
1、95%乙醇
2、无水乙醚
3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml
先配A液与B液
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。4、乙醇——乙醚混合液
乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）
（二）器具
1、离心机
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