无PAM限制的CRISPR/Cas9系统构建及效率验证
秦怀远，李和刚，张宁，辛京京，赵金山*
（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）
摘 要：CRISPR/Cas9系统在进行靶向基因敲除、转录激活以及抑制时，需要通过识别Cas9靶位点上的一个原间隔子相邻基序（PAM）序列进行特异性靶向基因编辑。现阶段，被广泛认可的化脓性链球菌SpCas9仅识别比较短的PAM为NGG（N为任意碱基，G为鸟嘌呤）。本实验在野生型SpCas9、PAM为NG的xCas9和SpCas9-NG的基础上，构建预期PAM为NNG的突变体SpCas9NNG、预期PAM为NNN的突变体xCas9NNN和ngCas9NNN，通过双荧光素酶报告基因检测评价其切割活性。结果显示：本次实验构建的ngCas9NNN突变体对PAM为NNN的靶标DNA具有显著的切割活性，为后续拓宽CRISPR/Cas9系统的靶向范围提供重要参考。 关键词：CRISPR/Cas9；无PAM限制；突变体；基因编辑
中图分类号：S813.3 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200510-01
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）源于Ⅱ型微生物适应免疫系
统，在该系统中细菌会通过入侵噬菌体和质粒来破坏基因组信息保护自己[1]。当病毒侵入个体，会释放出病毒DNA，当细菌检测到病毒DNA存在时会释放出2种RNA，其中sgRNA与病毒DNA相结合配对，另一种RNA指导合成Cas9蛋白并与sgRNA组成复合物，从而切断病毒DNA使其失效[2-3]。CRISPR/Cas9系统需要通过识别在Cas9靶位点上的一个原间隔子相邻基序（PAM）[4-6]序列进行特异性靶向基因编辑。目前广泛使用的化脓性链球菌SpCas9识别的PAM为NGG（N 为任意碱基，G为鸟嘌呤），也就是说它仅仅能识别靶向基因组中1/16的位点[7]，所以NGG的PAM并不能满足对广谱基因的编辑需求，因此研究者们试图通过降低PAM对CRISPR/Cas9使用的限制，来拓宽CRISPR/ Cas9系统的编辑范围。
Kleinstiver等[8]在野生型SpCas9的基础上，进行R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R 7个位点的定点突变，成功构建出了PAM仅为NG 的Cas9突变体SpCas9-NG。Hu等[9]运用噬菌体辅助持续演化（Phage-Assisted Continuous Evolution，PACE）[10]的方法来进化并拓展其识别的PAM序列获得了xCas9。xCas9比SpCas9有更高的DNA靶向特异性，而且将PAM的限制也降至了NG。Liu[11]团队证实xCas9在兔子中具有扩展PAM兼容性和增强的碱基编辑效率，可用于生物体中的精确基因修饰。而Chatterjee等[12]发现一种SpCas9的直系同源物，来自犬链球菌的ScCas9，其与SpCas9具有89.2%的同源性，在CRISPR/Cas9晶体REC3结构域[13-14]中，于367至376位插入了10个带正电荷的氨基酸（IKHRKRT
TKL），并且在1 337和1 338位置上插入了另外2个氨基酸（KQ）[15]，最后PAM进一步放宽至NNGN，而且也有较强的靶向切割活性。这些发现进一步拓展了CRISPR系统的靶向范围。
虽然上述研究已经将CRISPR/Cas9的PAM限制降低至NG（SpCas9-NG、xCas9等）以及NNG（ScCas9等），但是想要更加彻底地使用CRISPR/Cas9进行全基因组的无限制基因编辑，就必须进一步降低PAM的限制。所以，在本实验中，ScCas9在有关控制PAM的结构域中多出12个氨基酸，在野生型SpCas9氨基酸序列的基础上，引入ScCas9的氨基酸序列特点（插入特定的
收稿日期：2020-05-10；修回日期：2020-06-09
资助项目：国家自然科学基金（31572383、31301936）；青岛市民生科技计划（19-6-1-68-nsh、19-6-1-63-nsh）；山东省草学一流学科建设经费
作者简介：秦怀远（1994-），男，内蒙古呼和浩特人，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：**************** *通讯作者：赵金山，男，教授，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：****************
12个氨基酸），期望可以将野生型的SpCas9的NGG PAM降低至ScCas9的NNG PAM；同时在SpCas9-NG和xCas9氨基酸序列的基础上，引入ScCas9的氨基酸序列特点（插入特定的12个氨基酸），期望能将SpCas9-NG或xCas9的PAM（NGN）限制彻底消除。
1 材料与方法
1.1实验材料迪庆绵羊皮肤成纤维细胞（DQSHS1）购自中国科学院昆明动物研究所，目录号：KCB90012S；pX330（编码野生型SpCas9）质粒购自Addgene公司，货号：#42230，pX330-NG（编码SpCas9-NG）、pX330-xCas9（编码xCas9）质粒由本实验室在pX330基础上构建而成；SSA-DKK2报告载体由本实验室保存；BbsI限制性内切酶购自NEB公司，货号：R3539S；DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司，货号：AIG1025A；T4 DNA连接酶购自天根生物公司，货号：B0202S；DNA胶回收试剂盒购自天根生物公司，货号：DP209-02；去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，货号：D6948-01；Lipo 3000脂质体购自美国Invitrogen 公司，货号：L3000015；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京原平皓生物科技有限公司，货号：LF103-01；DNA寡核苷酸由擎科公司合成。
1.2 载体构建
1.2.1 向导RNA通用表达载体pCas9-sgRNA设计与构建向导RNA通用表达载体pCas9-sgRNA载体依次包含如下元件：
U6启动子：
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTG CATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATT
GG AATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACA AAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACT ATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATT TCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAAC ACC
spacer克隆位点（2个反向的BbsI位点，2个BbsI位点之间插入330 bp随机序列）：
GGGTCTTCG
GGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGT GGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTC TGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTT GTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGC CGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATG CGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTC GGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGA AGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATG GCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGT CGGGGTAGCGGCTGAAGCA
AGAAGACCT
sgRNA下游序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
U6终止子：TTTTTT
bGH polyA：
CTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCT TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCC CGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCA CTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGG TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTG GGAAGAgAATAGCAGGCATGCTGGGGA
把上述序列插入到pUC57的EcoR V位点，此过程委托青岛擎科生物技术有限公司完成。
1.2.2 靶标的设计与载体构建在绵羊基因库中出绵羊DKK2基因（NC_040257.1，21620923~21621362，440 bp），并将其第一外显子编码复制出来，设计NNG PAM、NNN PAM的
靶标，合成相应的寡核苷酸，其序列信息如表1，引物委托青岛擎科生物技术有限公司合成。
将NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3的上游引物和下游引物两两退火，在PCR仪中进行退火过程。退火条件设定为95℃ 5 min，72℃ 10 min，后置于冰上，得到6条双链寡聚核苷酸。
使用Bbs I内切酶对pCas9-sgRNA通用表达载体在37℃恒温培养箱进行3 h的酶切，其中酶切体系为50 μL：5 μL Buffer、2 μL内切酶、28 μL超纯水，15 μL pCas9-sgRNA。将酶切产物进行凝胶电泳确定切开后，对酶切产物的3 300 bp条带进行切胶回收实验，将6条退火的双链寡核苷酸与胶回收产物用T4连接酶在4℃冰箱进行过夜连接，其中连接体系为10 μL：4 μL退火引物，4 μL酶切产物，1 μL T4连接酶，1 μLBuffer；
次日将所得连接产物用DH5α进行转化，涂板，并将培养皿放置于37℃培养箱进行过夜培养。
挑取单菌落加入到含有1 mL LB（含50 mg/mL 氨苄青霉素）的1.5 mL离心管中，37℃ 200 rpm摇菌7~8 h，分别使用NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3的上游引物与特异性反向引物X2-R进行菌落PCR扩增，其中PCR反应体系为25 μL：22 μL金牌mix、1 μL上游引物、1 μL X2-R、1 μL菌液。PCR反应参数为热盖105℃，95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，上述过程循环29次，72℃ 5 min，16℃保存。检测相应单菌落，扩增后通过凝胶电泳，筛选120 bp左右条带
的阳性菌落送往青岛擎科生物技术有限公司进行测序验证（测序引物为X2-R）。
1.2.3 SpCas9-NNG、ngCas9NNN、xCas9NNN突变体的构建在原有的野生型SpCas9、突变体SpCas9-NG和xCas9的基础上，进一步进行ScCas9中的12个氨基酸序列的插入。野生型SpCas9、突变体SpCas9-NG和xCas9对应的表达Cas9蛋白的氨基酸序列，在367位置插入IKHRKRTTKL十肽，在1 337、1 338 2个位点插入KQ二肽。此过程委托青岛擎科生物技术有限公司完成。
1.3 细胞转染取生长状态良好的绵羊成纤维细胞，先将细胞进行稳定培养传代，在3~5代细胞生长活性较强时进行24孔板的铺板。在孔内细胞密度达到75%左右时进行细胞瞬时转染。本次实验分SpCas9-NNG、ngCas9NNN和xCas9NNN 3个部分，每个实验有4组，分别为对照组和3个实验组，3个实验组分别由pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2、pCas9-sgRNA NNNT3与突变体、SSA-DKK2表达载体进行共转染，将未连接sgRNA的空白通用表达载体pCas9-sgRNA 与突变体、SSA-DKK2表达载体作为对照组，该实验采用单一变量法，对照组加未连接靶标引物的pCas9-sgRNA通用表达载体。其他实验组分别加入pCas9-sgRNA T1、pCas9-sgRNA T2、pCas9-sgRNA T3。实验在不同代数的细胞重复转染2次，转染48 h后，进行双荧光素酶活性的测定，以达到验证3种突变体是否具有切割活性的目的。
1.4 双荧光素酶报告基因检测
四楞筋骨草1.4.1 细胞裂解将转染48 h后的24孔板中的培养基吸出来，每孔加入100 μL PBS进行润洗，重复2次，除掉的细胞以及杂质。每孔加入100 μL稀释好的细胞裂解液，常温静置30 min进行裂解。
1.4.2 萤火虫荧光素酶活性测定将裂解好的细胞进行柔和吹打混匀，取100 μL Luciferase Assay Reagent加入Promega GloMax 20/20发光检测仪测定管底部，加入20 μL待测样品（裂解好的细胞），轻轻混匀后，放入仪器中进行检测。
1.4.3 海肾荧光素酶活性测定萤火虫荧光素酶活性测定之后，直接向取出的离心管中加入100 μL的终止液SR，轻柔吹打混匀后，放入仪器进行检测，Stop Reagent可以立即终止萤火虫荧光素酶发光，并且同时启动海肾荧光素酶发光反应。记录海肾荧光素酶反应强度（RLU2）与萤火虫荧光素酶反应强度（RLU1）的数值，计算2组数据的比值，即RLU2/RLU1（简写为R2/R1）。
1.5 统计分析将双荧光素酶活性检测结果数据RLU1、RLU2记录下来，并计算R2/R1，记录于Excel表格中，计算试验组3组的平均值，然后使用t检验对各组结果差异显著性进行分析（将试验组与对照组进行比较，试验组之间不做对比），P≤0.01为差异极显著，P≤0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果与分析
2.1 引物退火如图1所示，两条单链寡聚核苷酸链通
表1 DNA寡核苷酸序列
引物引物序列（5'→3'）靶位点序列（5'→3'）
NNGT1F：CACCGGTGCTGGGCCCCCAAAGCC；R：AAACGGCTTTGGGGGCCCAGCACC GGTGCTGGGCCCCCAAAGCC NNGT2F：CACCGATGCGGGGCAAGGACTCCTC；R：AAACGAGGAGTCCTTGCCCCGCATC GATGCGGGGCAAGGACTCCTC NNGT3F：CACCGGGCCAAACTCAACTCCATC；R：AAACGATGGAGTTGAGTTTGGCCC GGGCCAAACTCAACTCCATC NNNT1F：CACCGGACTGGCTTTCGGCGGCAG；R：AAACCTGCCGCCGAAAGCCAGTCC GGACTGGCTTTCGGCGGCAG NNNT2F：CACCGGACCCCTCGCCGGGAGATG；R：AAACCATCTCCCGGCGAGGGGTCC GGACCCCTCGCCGGGAGATG NNNT3F：CACCGCGGTGCTGATGGTGGAGAGC；R：AAACGCTCTCCACCATCAGCACCGC GCGGTGCTGATGGTGGAGAGC X2-R CAGTGGGAGTGGCACCTT
过退火，配对形成一条20 bp的双链寡聚核苷酸链，通过凝胶电泳，1~6个孔均为明亮单一条带，说明引物退火成功。
2.2 pCas9-sgRNA酶切如图2所示，pCas9-sgRNA空载体通过Bbs I酶切，产生3 300 bp、300 bp 2条
带，切
胶回收3 300 bp条带。
2.3 菌液PCR及测序结果 NNG、NNN各有3对退火引物的连接产物，每组挑5个单个菌落进行菌液PCR，PCR 结果通过凝胶电泳检测，结果见图3-A，1~15为pCas9-sgRNA NNGT1，pCas9-sgRNA NNGT2以及pCas9-sgRNA NNGT3，其中只有11显阴性，其余全为阳性，挑选4、5、8、9、12、13送至青岛擎科生物技术有限公司进行测序。图3-B中，1~15为pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2以及pCas9-sgRNA NNNT3，其中4、5、7、10、14、15号孔电泳条带单一明亮，显示为阳性，送至青岛擎科生物技术有限公司进行测序。
2.4 pCas9-sgRNA靶标载体构建结果如图4所示，A、
营养块B、C、D、E、F测序峰图表明，靶标均准确连入通用表达载体pCas9-sgRNA上，NNG、NNN 2种PAM的靶标载体pCas9-sgRNAT1、pCas9-sgRNAT2、pCas9-
2.5双荧光素酶检测结果双荧光素酶检测后，将实验
组结果与对照组进行SPSS分析，对照组无sgRNA进
行引导，所以ngCas9NNN突变体无切割效率，而实验
龙脑抑菌剂
组ngCas9NNN突变体在sgRNA的引导下，对目的基
A~C：pCas9-sgRNA NNG靶标载体测序结果，D~F：pCas9-sgRNA NNN靶标载体
测序结果。
图4靶标载体测序峰图
M：DL10000 DNA Marker；D：空白质粒对照；1~15：均为菌液PCR。
A为pCas9-sgRNA NNG菌液PCR鉴定结果；B为pCas9-sgRNA NNN菌液PCR鉴
定结果。
图3 菌液PCR鉴定结果
M：DL10000 DNA Marker；1为酶切产物，2为空载体质粒对照。
图2 pCas9-sgRNA酶切结果
M：DL2000 DNA Marker，1~3：3对NNG退火引物，4~6：3对NNN退火引物。
图1 引物退火结果
A
B
T2
CCTGCCGCCGAAAGCCAGTCCGGTGTT
T2
T2
T3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M D 11 12 13 14 15
10000 bp
4000 bp
鹿头标本2000 bp
1000 bp
500 bp
光伏组件检测250 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
10000 bp
7000 bp
4000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
250 bp
10000 bp
1000 bp
500 bp
250 bp
M 1 2
M 1 2 3 4 5 6
因进行了有效的靶向切割，如图5-A 所示，实验组1、2与对照组相比差异极显著；实验组3与对照组相比差异显著。结果说明ngCas9NNN 突变体有显著的DNA 双链切割活性。
如图5-B 所示，xCas9NNN 突变体试验，与对照组进行的双荧光素酶检测结果对比，只存在一定的切割活性，但活性不高。
如图5-C 所示，SpCas9-NNG 突变体试验，与对照
组进行的双荧光素酶检测结果对比，有一定切割活性，但是活性不高。
3 讨 论
本研究针对在PAM 识别相关的结构域中，寻与PAM 识别有关的关键位点，进行氨基酸的突变插入，没有进行定点突变。实验是在ScCas9、野生型SpCas9、xCas9和SpCas9-NG 的基础上，将2种Cas9蛋白的PAM 限制特点进行中和，优势互补，针对SpCas9-NG 和xCas9，在第3位PAM 的限制蛋白序列中，引入SpCas9-NG 和xCas9的氨基酸序列特点，在第2位
PAM 的限制蛋白序列中，引入了ScCas9的第2碱基的相关蛋白结构域中的氨基酸取代组合，期望进一步扩大野生型SpCas9、xCas9、SpCas9-NG 的编辑范围。
在晶体结构分析中，SpCas9识别NGG ，主要是通过R1333和R1335这2个氨基酸分子结构侧链与NGG PAM 的第2位和第3位的核碱基之间的氢键识别
[16]
。
野生型SpCas9的氨基酸序列中，E1219位置上的谷氨酸与R1335的精氨酸，在空间结构会形成一个双齿盐桥[17-18]，这个双齿盐桥保持了其对PAM 第3位核碱基的识别稳定性，所以在xCas9的氨基酸序列中，E1219
的定点突变（E1219V ）是xCas9降低PAM 识别限制的至关重要的突变，它的存在降低了E1219与R1
335的盐桥的空间作用力，使得R1335在识别PAM 过程中的结构松动，放松对第3位核碱基G 的识别，从而使xCsa9的PAM 限制与野生型SpCas9相比降至NG 。而与野生型SpCas9的氨基酸序列比较，其他6个位点的突变则是为了使xCas9的DNA 靶向特异性提高。
本研究中，SpCas9-NNG 、ngCas9NNN 和xCas9NNN 都是在野生型SpCas9、SpCas9-NG 和xCas9的氨基酸序列基础上，引入ScCas9的氨基酸插入特点，最后得到突变体SpCas9-NNG 、ngCas9NNN 和xCas9NNN 。
野生型SpCas9的PAM 为NGG ，只单纯的加入12个氨基酸，在E1219位点没有进行任何突变，所以可能不会破坏E1219位置上的谷氨酸与R1335的精氨酸之间的盐桥作用力，而且没有使Cas9蛋白放松对第二位核碱基的识别，猜想可能由于野生型SpCas9与ScCas9本身存在的差异，致使野生型SpCas9仅仅通过插入12个氨基酸，并不能降低其对第2位核碱基识别的放松。对于突变体ngCas9NNN 和xCas9NNN ，这两者本身的
A ：ngCas9NNN 转染；
B ：xCas9NNN 转染；
C ：SpCas9-NNG 转染。
图5 双荧光素酶报告载体检测法检测结果
R2/R1R2/R1R2/R10.04
0.030.02
0.01
0.00
0.15
0.10
0.05
0.00
0.08
0.060.04
0.02
0.00
报告基因相对活性
报告基因相对活性
报告基因相对活性
对
照
组
对
照
组
对
照
组
试
验
组
1
试
验
组
1
试
验
组
1
试
验
盐酸环丙沙星凝胶
组
2
试
验
组
2
试
验
组
2
试验组
3
试验组3
试验组3
A
B
C
c
a
a
a
ab
ab
a
b
b
b
b
b
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