多聚泛素链及泛素衍生物的化学合成研究

摘要

蛋白质泛素化作为一类作用方式复杂且作用结果多样的重要蛋白质翻译后修饰，几乎参与了真核生物的所有生命活动。诸如蛋白质降解、细胞的分裂、生长、细胞间的信号转导、细胞的运动及凋亡等。前人发展了多种获取泛素化蛋白的合成策略。酶法由于缺乏特异性的酶系统而无法获取某些泛素化蛋白。蛋白质体外化学合成凭借其能够在原子尺度精准构筑蛋白质的优势，为获取精确尺寸，不同连接类型的泛素链提供了有效的途径，但合成步骤繁琐、工作量大。为解决上述问题，前人提出了一类基于化学连接反应构筑非天然异肽键泛素链的方法。然而，该策略需要首先对泛素片段进行化学改造，且连接反应效率较低。此外，绝大部分模拟异肽键与真实体系结构差别较大。基于此，发展一种新策略用于高效获取性质均一的泛素链具有重要的科学意义。本文研究工作利用蛋白质化学合成技术，围绕泛素链及泛素衍生物的化学合成展开研究。第一个工作，我们首先通过小分子与蛋白片段巯基间的Thiol-ene 偶联实现辅基与泛素片段间的高效装载，然后通过自然化学连接反应将装载有辅基的泛素片段与泛素酰肼进行连接，实现了泛素链的高效合成，克服了之前的大分子与大分子之间偶联效率低的问题。通过该方法，我们高效合成了K48、K27 位链接类型二泛素链。第二个工作，我们发展了一种可以高效快速地合成泛素探针Ub-AMC 的新方法。Ub-AMC 作为一种泛素探针目前已被广泛应用于去泛素化酶酶活测定、去泛素化酶抑制剂高通量筛查。然而，目前合成Ub-AMC 的方法主要有化学全合成和片段连接法。这二种方法都有合成步骤繁琐、工作量大、成本高的缺陷，基于此，我们发展一种可以高效便捷的合成百毫克级的

Ub-AMC 新方法，并通过去泛素化酶酶解实验验证了合成的泛素探针可以很好的应用于DUB 酶活动力学性质探究及DUB 抑制剂的筛查。

关键词：Lys48 位链接泛素链、Lys27 位链接泛素链、泛素衍生物、蛋白质化学合成、硫醇-烯烃反应

ABSTRACT

Protein ubiquitination, as a kind of important post-translational modification of the important protein with various effects and diverse results, is involved in almost all life activities of eukaryotes. Such as protein degradation, cell division, growth, cell signal transduction, cell movement and apoptosis. Former people developed a variety of synthetic strategies for obtaining ubiquitinated proteins. Enzymatic methods fail to obtain certain ubiquitinated proteins due to the lack of specific enzyme systems. Protein in vitro chemical synthesis provides an effective way to obtain precise size and different types of ubiquitin chains because of its advantages of being capable of accurately constructing proteins at the atomic scale, but the synthesis steps are complicated and the workload is large. In order to solve the above-mentioned problems, previous researchers proposed a method for constructing non-natural isopeptide ubiquitin chains based on chemical ligation reactions. However, this strategy requires that the ubiquitin fragment be first chemically engineered and the liga

tion reaction be less efficient. In addition, the vast majority of mimic isopeptide bonds differ greatly from the true structure. Based on this, it is great scientific significance to develop a new strategy for efficiently obtaining uniform ubiquitin chains. In this paper, protein chemical synthesis technology is used to study the chemical synthesis of ubiquitin chains and ubiquitin derivatives. In the first work, we first performed efficient loading between prosthetic and ubiquitin fragments by Thiol-ene coupling between small molecules and protein fragment sulfhydryls, and then through the natural chemical ligation reaction, the ubiquitin fragments loaded with auxiliary and the ubiquitin hydrazides are linked to achieve efficient synthesis of ubiquitin chains, overcoming the previously low coupling efficiency between macromolecules and macromolecules. By this method, we efficiently synthesize K48 and K27-linked diubiquitin chains. In the second work, we developed a new method for the efficient and rapid synthesis of ubiquitin probe Ub-AMC. As an ubiquitin probe, Ub-AMC has been widely used in deubiquitinase enzymatic assays and high-throughput screening for deubiquitinase inhibitors. However, the current methods for the synthesis of Ub-AMC mainly include chemical total synthesis and fragment ligation. Both of these methods have the drawbacks of tedious synthesis steps, heavy workload, and high cost. Based on this, we develop a new method for the efficient synthesis of one-hundred milligrams of Ub-AMC that can be efficiently digested by deubiquitinase. The

experiment verified that the synthesized ubiquitin probe can be well applied to explore the dynamic mechanical properties of DUB enzyme and the screening of DUB inhibitors.

KEYWORDS:Lys48-linked Ubiquitin Chain; Lys27-linked Ubiquitin Chain; Ubiquitin derivative; Protein Chemical Synthesis;Thiol-ene Reaction

第一章引言 (1)

1.1蛋白质科学 (1)9547900

1.2蛋白质化学合成的发展历程 (1)

1.2.1多肽固相合成 (2)

1.2.2多肽片段连接 (3)

1.3自然化学连接及其发展 (7)

1.3.1自然化学连接反应 (7)

1.3.2自然化学连接反应中N端Cys的改进 (8)

1.3.3自然化学连接反应中的C端硫酯的改进 (14)

1.3.4表达蛋白连接 (18)

1.4本章小结 (19)

第二章多聚泛素链的合成 (21)

2.1引言 (21)

2.2实验部分 (31)

2.2.1试剂与仪器设备 (31)

2.2.2辅基连接臂的设计与反应条件的优化 (32)

2.2.3 K48位链接二泛素的合成 (35)

2.2.4 K27位链接二泛素的合成 (42)

纱窗角码

2.3本章小结 (47)

第三章泛素衍生物Ub-AMC的合成 (49)

3.1引言 (49)

3.2实验部分 (51)

3.2.1实验材料与仪器设备 (51)线圈缠绕机

3.2.2 Ub(1-75)-NHNH2的制备 (52)

3.2.3 Ub(1-75)-Mes的制备 (53)

3.2.4 Ub(1-76)-AMC的制备 (54)

3.2.5 Ub-AMC的结构与活性测试 (56)rrggg

3.3本章小结 (58)

第四章总结与展望 (59)胸章机

参考文献 (60)

附录：核磁共振氢谱图与高分辨谱图及酶活图 (71)

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 (77)

插图清单

图1.1 多肽固相合成的基本原理 (3)

图1.2 硫酯胺解反应示意图 (4)

图1.3 巯基捕获连接反应示意图 (4)

图1.4 亚胺捕获连接反应示意图 (5)

图1.5 自然化学连接示意图 (5)

图1.6 无痕Staudinger连接反应示意图 (6)

图1.7 酮酸-羟胺连接反应示意图 (6)

图1.8 KAHA连接反应示意图 (7)

图1.9 自然化学连接的基本原理 (8)

图1.10 在丙氨酸位点的自然化学连接示意图 (9)外墙陶土板

图1.11 Acm保护下的选择性脱硫 (10)

图1.12 自由基介导脱硫示意图 (10)

图1.13 巯基化的氨基酸 (10)

图1.14 辅基介导的多肽片段连接 (11)

图1.15 在组氨酸位点的连接反应示意图 (12)

图1.16 在甲硫氨酸位点的连接反应示意图 (12)

图1.17 在丝氨酸/苏氨酸位点的连接反应示意图 (13)

图1.18 硒代半胱氨酸的连接反应示意图 (14)

图1.19 Boc法制备多肽硫酯 (15)

图1.20 O到S的酰基迁移制备硫酯 (15)

图1.21 SEA方法制备硫酯 (15)

图1.22 苯并咪唑酮制备硫酯 (16)

图1.23（a）酰肼树脂的制备；（b）多肽酰肼法制备硫酯 (17)

图1.24 基于酰肼法的一锅连接-脱硫反应 (17)

图1.25 表达蛋白连接基本原理 (18)

图2.1 泛素蛋白的序列、结构及异肽键展示 (23)

图2.2 酶法对底物单泛素化及多聚泛素化 (24)

图2.3 基于甘氨酸辅基的泛素链合成策略 (25)

图2.4 基于巯基化Lys 的泛素链合成策略 (25)

图2.5 基于供体泛素甘氨酸76突变策略合成二泛素 (26)

图2.6 基于二硫键策略合成二泛素 (27)

图2.7 基于Click法合成二泛素 (28)

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