中国免疫学杂志2022年第38卷
CRISPR/Cas9系统在传染病诊疗中的应用进展① 高
哲
张荣荣
贾天军
（河北北方学院临床检验诊断学重点实验室，病原生物学与免疫研究所，张家口075000） 机器码注册码
中图分类号R318
文献标志码
A
文章编号
1000-484X （2022）09-1150-05
［摘
要］CRISPR/Cas 系统是一种源自细菌和古细菌的适应性免疫系统，经人工改造后发展成为一种强大的基因编辑 工具，使基础科学研究发生了革命性的变化。其中，CRISPR/Cas9系统是研究最为深入、发展最快的一种。随着CRISPR/Cas9系统的不断发展，越来越多关于CRISPR/Cas9系统的疗法进入临床试验。本文简要介绍CRISPR/Cas9系统的结构和作用机制，并对其在传染病诊疗中的应用进行综述。
［关键词］CRISPR/Cas9系统；病毒感染；寄生虫感染 Advances in application of CRISPR/Cas9system in diagnosis and treatment of infectious diseases内裤加工
GAO Zhe ，ZHANG Rongrong ，JIA Tianjun.Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnosis ，Institute of Pathogen Biology and Immunology ，Hebei North University ，Zhangjiakou 075000，China
［Abstract ］Clustered regularly interspaced short palindromic repeat /associated proteins （CRISPR/Cas ）system ，an adaptive
immune system derived from bacteria and archaea ，has engineered and developed into a powerful genome editing tool ，which has revolutionized the basic scientific research.CRISPR/Cas9system is the most deeply researched and fastest growing system.With the development of CRISPR/Cas9system ，increasing number of therapies about CRISPR/Cas9system have entered clinical trials.This paper briefly introduces the structure and mechanism of CRISPR/Cas9system ，and reviews its application in the diagnosis and treat⁃
ment of infectious diseases.
［Key words ］CRISPR/Cas9system ；Virus infection ；Parasite infection
规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regu⁃larly interspaced short palindromic repeat ，CRISPR ）/CRISPR 相关蛋白9（CRISPR -associated protein 9，
Cas9）系统是一种源自古细菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR/Cas9系统的快速发展使基因工程领域发生了革命性的变化。作为基因编辑的工具，
CRISPR/Cas9系统相对于锌指核酸酶（ZFNs ）和转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs ）更加简单，并具有独特的切割机制，可靶向多个区域，因此被广泛采用，成为大多数基因编辑的首选工具。
近年来研究发现，CRISPR/Cas9系统可以作为一种新的方法用于某些疾病的预防和，如慢性肝炎、寄生虫感染和人类免疫缺陷病毒（human immune
deficiency virus ，HIV ）感染。本文着重对CRISPR/
Cas9系统在传染病诊疗中的最新应用进展进行综述。
1
CRISPR/Cas9系统的基本结构及作用机制
84%的古细菌和45%的细菌中均存在CRISPR/
Cas 单元，这是一种抵御外来噬菌体和外源DNA 的免疫机制［1］。CRISPR/Cas 系统基因组序列由CRIS⁃PR 基因座、Cas 基因和tracrRNA 构成。CRISPR 基因座包括前导序列（leader ）、间隔序列（spacers ）和重
复序列（repeats ）［2］
。前导序列位于重复序列的上游，含有CRISPR 系统的启动子；间隔序列是一段回文结构，位于重复
序列之间，可识别外源DNA ；重复序列是一段高度保守序列，其序列的5'端为GTTTG ，3'端为GAAAC ［3］。Cas 基因位于CRISPR 基因座侧旁，编码对目标DNA 进行特异性切割的Cas 蛋白。tracrRNA 具有与CRISPR 短重复序列互补的区域，起连接crRNA 和Cas 蛋白的作用，是CRISPR/Cas9系统成熟并发挥作用的关键［4］。
doi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2022.09.024
①本文为河北省自然科学基金资助项目（C2020405014）。作者简介：高
哲，男，硕士，主要从事衣原体相关研究，E -mail ：
731625156@qq 。
通信作者及指导教师：贾天军，男，博士，教授，硕士导师，主要从事
抗感染免疫相关研究，E -mail ：452871832@qq 。
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高哲等CRISPR/Cas9系统在传染病诊疗中的应用进展第9期
目前应用最广，研究最深的是CRISPR/Cas9系统，其结构比其他类型的CRISPR/Cas系统更加简单，标志蛋白为Cas9蛋白［5］。CRISPR/Cas9系统作用机制大致可分为3个阶段：①新间隔序列的获取：通过对入侵的外源DNA进行扫描，Cas9识别潜在的原型间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motif，
PAM），以确定原型间隔序列。然后对外源DNA进行切割，产生新的间隔序列，储存到CRISPR/Cas系统中［6］；②CRISPR基因座的表达：首先CRISPR基因座转录为前体crRNA（pre-crRNA）和tracrRNA。pre-crRNA被加工为成熟的crRNA后和tracrRNA形成引导序列sgRNA，将指导Cas9靶向并切割入侵的DNA［4］；③防御阶段：sgRNA与Cas9结合，识别靶DNA PAM位点，并在目标位点引入双链断裂（DSB）［7］。DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）的方式进行修复，并通过这2种方式实现特定基因的插入、校正、破坏和缺失。CRISPR/ Cas9系统是迄今为止最简单、有效和多功能的系统，只需设计sgRNA即可在任何DNA靶点生成DSB。对CRISPR/Cas9系统作用机制的研究，为其体外应用提供了理论依据。因此，这种编辑技术已在科学界迅速普及。
可视化调度系统2CRISPR/Cas9系统在病毒感染中的应用2.1在HIV中的应用通过CRISPR/Cas9对真核细胞有效的基因编辑，科学家们发现这种方法可用于人类病毒感染。研究表明，CRISPR/ Cas9基因编辑是HIV感染的一种新方法。EBINA等［8］设计了一种针对HIV基因组中长末端重复序列（LTR）的CRISPR/Cas9系统，并在人类T细胞来源细胞系Jurkat细胞中进行测试。实验证明CRISPR/Cas9系统
可以在LTR区域切割病毒基因组，诱导突变，甚至具有从宿主细胞基因组中消除内部整合HIV基因的能力。由此表明CRISPR/Cas9系统可以HIV潜伏感染。LIAO等［9］将Cas9和gRNA整合到人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）基因组中，生成CRISPR/Cas9-hPSCs。将CRISPR/Cas9-hPSCs分化为相对均一的细胞，用HIV感染这些细胞，研究人员发现这些细胞对HIV有明显的抵抗力。实验结果揭示CRISPR/Cas9系统具有HIV感染新策略的潜力。
然而，由于HIV可逃避CRISPR/Cas9的编辑，利用CRISPR/Cas9系统HIV仍有限制性。研究发现，通过靶向共同受体也可抑制HIV感染，其中CCR5是最重要的一种受体。XIAO等［10］使用CRISPR/Cas9和2个sgRNA共同编辑CCR5，并通过NHEJ途径阻断CCR5的表达，增强了CD4+T细胞对人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type1，HIV-1）的抵抗力，为抗HIV-1/AIDS的潜在基因方法提供新的途径。PSIP1基因编码的LEDGF/p75是整合酶的辅助因子，是HIV基因整合到宿主细胞染体所必须的。LAMPI等［11］使用CRISPR/Cas9对PSIP1位点进行顶点编辑，将第366位的天冬氨酸残基转化为天冬酰胺（D366N），中断了LEDGF/p75与HIV整合酶的相互作用，但不会影响LEDGF/p75在细胞内的功能。研究人员发现，D336N细胞中HIV复制减弱，表明靶向LEDGF/p75有助于HIV的。
miRNAs在各种疾病中的功能是近年来研究的热点问题。miR146是一种与HIV感染相关的mi-RNA。研究发现，miR-146a可减少CD4+T细胞计数，并降低抗病毒细胞因子的产生和活化的CD8+T细胞的细
胞毒作用［12］。TENG等［13］通过CRISPR/Cas9系统敲除miR-146a，破坏miR-146a细胞因子通路，增加细胞因子和干扰素刺激基因的表达，从而加强对HIV感染的抗病毒反应。因此，使用CRISPR/Cas9系统靶向miRNAs有助于HIV的。最近研究发现，通过CRISPR/Cas9系统激活内源性的抗病毒化合物Tetherin基因，增加其表达可抑制HIV复制［14］。另一方面，科学家目前已经可以使用CRISPR/Cas9系统体外编辑人的B细胞，使其表达抗HIV-1广谱中和抗体，并保留其参与体液免疫的能力，用于HIV 的［15］。总之，CRISPR/Cas9是HIV的新方法，但目前仍存在一定的局限性，需要进一步的研究。
2.2在肝炎中的应用肝炎病毒感染是引起肝炎的主要原因，其中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是最危险且最常见的。HBV是一种DNA病毒，通过与钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白结合入侵肝细胞［16］。HBV基因组进入细胞核后，由松弛的环状DNA转化为共价闭合环状DNA（cccDNA），并整合到肝细胞基因组中。机体HBV免疫应答是造成肝损伤的主要原因，特别是细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）可清除HBV感染的肝细胞，直接造成肝损伤［17］。如果不及时，慢性乙型肝炎可转化为肝硬化。目前临床HBV感染的方法主要是逆转录酶（reverse transcriptase，RT）抑制剂和基于IFN-α的免疫调节剂。然而，这些药物均存在一个缺点，
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中国免疫学杂志2022年第38卷
那就是它们不能根除cccDNA，停药后HBV复制反弹。目前，研究人员正在探寻效果更好、更彻底的方法，其中通过CRISPR/Cas9系统HBV感染取得了一定的进展。
CRISPR/Cas9HBV感染的主要趋向是降低肝内HBV cccDNA表达，从而抑制HBV的慢性感染。RAMANAN等［18］使用CRISPR/Cas9系统靶向和切割HBV基因组保守区域，显著降低HBV cccDNA表达水平，证明了Cas9进行cccDNA定向抗病毒的潜力。最近，KOSTYUSHEV等［19］的实验结果显示CRISPR/Cas9可导致cccDNA降解和移码突变，从而显著降低cccDNA产生病毒RNA的能力。与脑膜炎奈瑟菌（neisseria meningitidis，Nm）和弗朗西斯氏菌（francisella novicida，Fn）相比，来自化脓链球菌（streptococcus pyogenes，Sp）和嗜热链球菌（strepto⁃coccus thermophilus，St）的CRISPR/Cas9系统有效靶向HBV cccDNA降解和抑制HBV复制，在转染后6d内导致90%以上的HBV cccDNA降解，抗HBV 活性更高，并且更加安全。然而Sp CRISPR/Cas9与腺相关病毒（adenovirus associated，AAV）载体不兼容，存在运输困难的问题。为了解决这一问题，研究人员在金黄葡萄球菌（staphylococcus aureus，Sa）中鉴定出更小的Cas9蛋白，以AAV为载体运输。并且研究发现，Sa CRISPR/Cas9系统可以准确有效地靶向HBV基因组并抑制HBV的复制，可以作为
慢性HBV感染的一种新策略［20］。另一方面，WANG等［21］构建了一种HBV特异性gRNA-miR-HBV-gRNA三元盒以探究miR-31对CRISPR/Cas9在消除HBV cccDNA中的作用。实验结果显示miR-31与2种HBV特异性gRNA在抑制HBV复制方面具有协同作用，可增强CRISPR/Cas9清除HBV cccDNA和抑制HBV复制的能力。对于修复通路在CRISPR/Cas9抗HBV活性中作用的研究在近期也取得了一定进展。KOSTYUSHEV等［22］使用NHEJ的强抑制剂NU7026，发现抑制NHEJ会削弱CRISPR/ Cas9对HBV cccDNA的降解，从而说明了NHEJ对于CRISPR/Cas9抗HBV的重要性，并且也进一步证明了CRISPR/Cas9对于降解cccDNA的高效性。以上实验均表明CRISPR/Cas9系统有望用于临床人体HBV感染。
CRISPR/Cas9系统的DNA靶向性已经被广泛研究。然而，HCV是一种RNA病毒，CRISPR/Cas9系统靶向RNA的潜在作用需要进一步验证。研究人员在Fn中鉴定出一种既能靶向DNA又能靶向RNA的CRISPR/Cas9系统。该CRISPR/Cas基因座中包含1个独特的小RNA，称为CRISPR/Cas相关小RNA（scaRNA）［23］。scaRNA的功能与crRNA几乎相同：它与tracrRNA相互作用，与Fn Cas9形成靶向复合物。PRICE等［24］开发了针对HCV基因组的RNA 靶向引导RNA（rgRNA）。rgRNA具有与sgRNA相似的设计，包含与单链scaRNA结合的tracrRNA序列。通过产生与HCV基因组互补的scaRNAs序列，Fn Cas9可以与HCV RNA特异性地相互作用。并且通过实验表明Fn Cas9系统可以靶向并抑制HCV基因的复制和表达，证明了CRISPR/Cas9系统HCV 感染的可行性。近年来，研究者在此方面进行了大量的研究。
长链非编码RNA（long noncoding，lncRNAs）在许多细胞生理过程中起着重要的调控作用。其中lncRNA-IFI6是1种新的lncRNA，独立于JAK-STAT 途径调节HCV感染，可负调控干扰素诱导蛋白6（interferon-induced protein6，ITIF6）启动子，从而增加HCV复制。LIU等［25］研究表明CRISPR/Cas9对lncRNA-IFI6基因的突变诱导和破坏可抑制HCV感染。另一方面，DUAN等［26］使用CRISPR/Cas9-gRNA 或siRNA过度表达或敲除miR-130a和其靶基因自噬相关基因5（autophagy-related gene5，ATG5），发现ATG5显著上调HCV复制并下调ISGs表达。由此证明了miR-130a通过ATG5依赖性自噬途径靶向ATG5以调节宿主抗病毒反应和HCV复制。虽然目前对CRISPR/Cas9系统HCV感染的研究取得一定进展，但就目前的研究成果来看，将CRISPR/ Cas9系统广泛应用于临床上仍需要很长的一段时间。
2.3在新型冠状病毒研究中的应用冠状病毒是引起人类呼吸系统和神经系统疾病的常见病因。2019年世界爆发了由未知病毒引起的肺炎疫情，通过对患者分泌物的检测确定这是1种先前未知的冠状病毒，世界卫生组织将其命名为“COVID-19”。准确、快速的诊断工具对于控制疫情至关重要。研究发现，CRISPR/Cas系统在COVID-19肺炎诊断中有很大潜力，尤其是CRISPR/Cas13系统具有很好的诊断效果［27］。由于目前缺少抗病毒药物和疫苗，因此迫切需要动物模型。SUN等［28］利用CRISPR/Cas9敲入技术建立了一个表达人血管紧张素转换酶Ⅱ（human angiotensin converting enzyme，hACE2）的小鼠模型，探究严重急性呼吸道综合征2型冠状病毒（SARS-CoV-2）的传播和发病机制。小鼠模型中
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高哲等CRISPR/Cas9系统在传染病诊疗中的应用进展第9期
hACE2的组织分布与COVID-19患者的临床发现相吻合，在肺中检测到高水平的hACE2表达。并且发现老年hACE2小鼠的病理变化更接近COVID-19患者。因此，该模型有望成为评价COVID-19疫苗和方法的工具。
3CRISPR/Cas9系统在寄生虫感染中的应用CRISPR/Cas9系统不但可以病毒感染，在寄生虫感染方面也具有潜在的疗效。在克氏锥虫线粒体钙离子摄入蛋白1（MICU1）和MICU2对其致病性影响的研究中，研究人员使用CRISPR/ Cas9技术敲除这2个基因，观察到敲除MICU1和MICU2的克氏锥虫的生长速度减缓并且侵袭能力降低［29］。其结果揭示了这2种基因似乎在克氏锥虫致病性中起着关键作用，利用CRISPR/Cas9技术对其进行靶向，有望成为锥虫病的新途径。
恶性疟原虫是一种引起疟疾的寄生虫。恶性疟原虫的线粒体核糖体对维持线粒体膜电位和寄生虫生存能力至关重要。LING等［30］利用CRISPR/ Cas9技术敲除了PfmtRPS12和PfmtRPS18基因，发现恶性疟原虫出现生长衰竭，从而表明对恶性疟原虫线粒体核糖体的破坏抑制了线粒体的代谢能力，使寄生虫对靶向线粒体功能的抑制剂过敏。恶性疟原虫线粒体电子传递链中的一些蛋白质是由线粒体中的线粒体核糖体翻译的。在另一项研究中，研究人员设计了能够靶向编码恶性疟原虫线粒体核糖体蛋
白L13（RPL13）基因的CRISPR/Cas9系统。实验结果证明CRISPR/Cas9敲除PfmRPL13可导致疟原虫线粒体膜电位丧失、生长停滞和死亡［31］。此外，研究表明，利用CRISPR/Cas9阻断恶性疟原虫中棒状体蛋白RON3基因的表达，可降低红细胞对葡萄糖的摄取，并损害疟原虫的生命周期［32］。
研究人员还探讨了CRISPR/Cas9弓形虫病的疗效。在最近的研究中，MA等［33］利用CRISPR/ Cas9技术敲除弓形虫wx2基因，结果表明wx2基因的缺失明显抑制了宿主细胞体外寄生虫的生长和复制，降低了小鼠体内寄生虫的毒力。在另一项研究中，研究人员运用CRISPR/Cas9技术敲除弓形虫免疫作图蛋白1（toxoplasma gondii immune mapping protein1，TgIMP1）基因，结果显示基因敲除株的增殖明显降低，毒力减弱［34］。总之，CRISPR/Cas9可能是一种更有效寄生虫感染的新方法，但其在寄生虫体内运输困难仍是目前需要解决的问题之一，希望未来能到解决这一问题的有效方法，使其更好的应用于临床。4总结与展望
CRISPR/Cas9技术具有高度的DNA特异性、较高的选择性和较低的副产物水平，其快速发展推动了基因编辑应用的迅速扩展，并对药物和生物技术研究产生了重大影响。目前，CRISPR/Cas9技术在各种细菌、病毒和寄生虫感染性疾病方面的应用受到广泛讨论。这项技术可以用来破坏病毒和寄生虫等传染源的基因组，或者破坏与病毒和非病毒感染的发病机制有关的宿主细胞基因，从而感染。而且通过与其他技术相结合，CRISPR/Cas9还可用于疫苗的研制。
然而CRISPR/Cas9基因编辑技术目前仍存在缺陷。其中，最关键的缺陷是其潜在的脱靶效应。研究人员目前已开发出许多方法来减少脱靶效应，如偏靶或无偏靶检测、碱基编辑、gRNA修饰和抗CRISPR（Acr）蛋白等［35］。但在临床广泛应用该技术疾病之前，还需要提高其效率、特异性和实用性。CRISPR/Cas9系统在临床方面有着巨大的潜力，未来必将改变疾病的方式，为人类健康保驾护航。
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［收稿2020⁃07⁃23修回2020⁃09⁃16］
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