FBDD+PPI典范：Bcl-2选择性抑制剂维奈克拉的药物设计（上）
——生物学背景——
细胞凋亡是一个高度受调控的过程，用于消除缺陷和不必要的细胞。与凋亡相关的调控过程的改变与包括癌症在内的许多疾病有关。当该调控机制无法对凋亡刺激作出反应，将导致缺陷细胞的积累和肿瘤的发生。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中起到重要的调控作用，可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等。促凋亡蛋白又可分为Bax蛋白家族（Bax,、Bak和Bok等）和BH3-only蛋白（Bad、Bid、Bim和Bik等）。Bcl-2/Bcl-xL与促凋亡蛋白的相互作用调节了细胞的凋亡过程。前人研究发现抗凋亡蛋白的过表达（特别是Bcl-2和Bcl-xL）与肿瘤进展、不良预后和耐药有关。因此，设计能靶向Bcl-2/Bcl-xL与促凋亡蛋白（如Bak和Bad，以下用BH3肽代表Bak和Bad与Bcl-2/Bcl-xL的相互作用的残基）的结合沟槽的小分子抑制剂可能是开发抗癌创新药的可行之计。该抑制剂不仅对依赖抗凋亡蛋白生存的癌细胞具有直接的细胞毒性，还能增强部分通过上调促凋亡因子发挥作用的化疗药物的细胞毒性。由于Bcl-xL的过表达与肿瘤细胞系的难治性相关性更高，因此Abbott（Abbott后来将其医药业务分拆上市，并取名Abbvie）的研究人员首先选择Bcl-xL和BH3肽的相互作用界面作为靶点，并采用基于片段的药物设计方法（FBDD）得到小分子抑制剂。 活性片段的筛选
研究人员使用”SAR by NMR”策略筛选10000个片段的分子库（平均分子量为210 Da），得到与Bcl-xL结合的氟联苯甲酸（表1中的1）。NMR滴定测定片段1的结合常数Kd为~300µM。对公司内部化合物库的联芳基类似物进行SAR研究（表1中的2-10），发现羧酸对于结合是关键的，而氟苯被氯苯或者萘环替换后Kd反而提高。片段1通过其羧酸与蛋白质的R139形成静电相互作用，在Bak的BH3肽（D83和R139）也观察到类似的相互作用。
将Bcl-xL/片段减速路拱1的复合物和Bcl-xL/BH3肽比较可发现邻近的第二个结合位点。第二个结合位点被BH3肽的I85的侧链填充。为了筛选到第二个片段，用过量的（2 mM）的1和含3500个片段的分子库（平均分子量为125 Da）做筛选，发现萘酚类似物和联芳基苯酚（表1中的11-20）在1过量下与Bcl-xL结合，与Bcl-xL的结合较片段1弱。
片段连接和linker筛选
利用NMR得到了Bcl-xL与片段1和11的三元复合物的结构，Bcl-xL三元复合物的七个低能结构叠加如图1所示，用多个linker将联苯甲酸的邻位连接到萘酚或联芳基，得到活性最好的化合物25（图2）的抑制常数（Ki）为1.4 µM，比片段1的效力提高了约200倍。由NMR模型可知，化合物25与蛋白疏水沟的两个相邻位点（口袋）相互作用。然而，从NMR模型中发现反式烯烃不是最佳的linker，因为由于烯烃对构象的限制，25并没有很好的深入到口袋里。
图1. 左：计算得到的Bcl-xL与片段1和11复合物的七个低能结构的叠加。1和11在能量最低的结构中用橙表示。右：化合物25与Bcl-xL结合的NMR模型。F97的侧链将位点1和位点2分开。
linker优化
茶叶电炒锅乙酰磺酰胺是羧酸常见的电子等排体，它们的pKa在3-5范围内。为了优化linker，研究人员尝试将联苯的羧酸替换为乙酰磺酰胺，合成了分子26，并测试其与Bcl-xL的结合。26与片段1的亲和力几乎相同（都在300 µM左右），说明乙酰磺酰胺确实可以替换羧酸。然后用乙酰磺酰胺作为新的linker，合成了120种酰基磺胺类药物，其中化合物28对Bcl-xL的亲
和力最大，抑制常数（Ki）达到0.245 µM。为了指导后续的优化，研究人员得到了28与Bcl-xL结合的NMR结构，发现与硝基相连的苯环位于F97上方和Y194下方，形成π-π堆积。这种相互作用在Bak和Bad的BH3肽中均未观察到。
图2. 酰基磺酰胺衍生物对Bcl-xL的亲和力数据。
位点2的第二轮分子优化
酰基磺酰胺的硝基苯基linker似乎提供了一种能量上有利的方式将位点1的片段与位点2的片段相连。为了优化位点2，进行了新一轮平行合成。根据药物化学原理和分子模拟等方法，得到了含125个分子的库。其中，分子31与Bcl-xL的亲和力最强，Ki达到36 nM。将31对接到Bcl-xL结合沟槽中，发现苯硫基有了一个特别的扭转角，导致其与硝基相连的苯环有分子内π-π堆积作用，同时为了适应31的构象，F97也向下旋转了一定角度。此外，硝基相连的苯环与Bcl-xL的Y194也有π-π堆积作用，正是这种叠加的π-π堆积作用使31在分子库中脱颖而出。
图3. 左：酰磺酰胺化合物28与Bcl-xL结合的NMR结构。硝基苯部分与蛋白的F97和Y194分
别形成π-π堆积。右：化合物31与Bcl-xL结合的NMR结构。28和31的硝基苯基部分均与蛋白质的F97和Y194形成π-π堆积作用。
图4. 从片段1和20优化得到苗头化合物31。
——从hit到先导化合物的发现——
化合物31的亲和力 (Ki) 为 36 nM。由于其水溶性差且与人血清白蛋白结合紧密，在血清中会严重失活。还需进一步优化。化合物31在1%的人的血清中与Bcl-xL的Ki下降69倍（从0.036 µM下降到2.50 µM），在10%的人血清中则几乎不会与Bcl-xL结合。研究人员测定了1%的人血清中不同组分对Bcl-xL/31的结合亲和力的影响，发现人血清白蛋白-III（human serum albumin-III，HSA-III）会导致31活性下降68倍（与1%的人血清中的69倍失活相当），表明HSA-III是31失活的主要驱动因素。研究人员得到了31的二甲基衍生物和HAS-III的NMR结构，31与Bcl-xL和HSA-III的不同结合模式提供了提高Bcl-xL结合选择性的可能性。相比于31在Bcl-xL中紧凑的分子内π-π堆积的构象（图5b），其与HSA-III的结合构象则更加舒展（图5c）。
基于结合差异的分子改造策略
为了方便解释，将分子分为site1、site2和site3三部分（图5a）。根据31与Bcl-xL和HSA-III结合构象的差异，分子可以从两个方面进行改造。一是site 1即联苯的氟原子端，该部位在Bcl-xL有额外的空间，并且部分暴露在溶剂中，而在HSA-III中则被疏水残基包围。可以通过增加site 1片段的极性或添加一个极性基团，来维持或改善化合物对Bcl-xL的亲和力，并减少对HSA-III的亲和力。二是site 3的苯硫基部位，该部位与Bcl-xL和HSA-III结合的环境分别是溶剂水和疏水残基，可以考虑添加极性基团。此前也有文献报道各种胺类以及极性基团如氨基甲酸酯、酰胺和砜能有效地降低分子与HSA-III的结合。薄膜线路
图5. (a) 分子31的结构及不同的site对应的子结构。(b) 31与Bcl-xL结合的示意图，箭头指向建议进行结构修饰的位置。(c) 31的二甲基衍生物与HSA-III结合的示意图，箭头指向建议进行结构修饰的位置。
优化site1
优化site 1的第一个策略是在联苯的末端连上一系列不同长度的极性（如酰胺和胺）基团。第二个策略是在不延长site 1片段的前提下，增加现有骨架的极性。两种策略的代表性分子分别是化合物火麻仁胶囊68和72（表2），都显示出类似于31的亲和力，且在血清中失活相对31有所
改善，说明在site 1增加化合物极性会导致血清失活减少的假设得到了验证。
表2. 31塑料表面电晕处理机、68和72的结构和对应的活性数据
优化site3
基于68和72的site 1片段，研究人员转向site 3的优化。基于朴素的有机知识，site 3最容易优化的起点显然是苯胺附近的碳原子。按照上述的策略推测，化合物的site 3往外延伸对Bcl-xL结合是没影响的，但会降低对HSA-III的结合。构效关系发现苯胺附近的碳原子的手性很关键，所有R手性化合物对Bcl-xL的亲和力都非常高，达到了1 nM。N原子带电的化合物在减少血清结合方面似乎特别有效，进一步的细胞EC50数据发现73R和79R（表3）在无血清条件和3%胎牛血清（3%FBS）存在下其它化合物活性更高。考虑到可合成性、化学修饰的可能性和药代动力学特征，研究人员选择73R做进一步的体外和体内实验，以测试其配合标准化疗对抗肿瘤生长的能力。
表3. 72、73R和79R的结构和对应的活性数据
73R的体内疗效
研究人员用A549细胞系（大量表达Bcl-xL）来评价联合的效果。在用紫杉醇处理A549细胞系48小时后加入73R，可使紫杉醇的细胞毒性增强21倍。对于移植A549肿瘤的免疫缺陷小鼠，73R增强了紫杉醇的抗肿瘤活性，且无明显毒性增加。单独使用紫杉醇只能使肿瘤生长被抑制两周，而紫杉醇+73R在期间可抑制肿瘤生长75%，肿瘤生长延迟明显增强。
乙酸乙酯实验装置——ABT-737：Bcl-xL/Bcl-2的双重抑制剂——
然而，73R在不同的人类肿瘤细胞系中很少或几乎没有单一药物的疗效。因为该化合物是针对Bcl-xL的结构设计开发出来的，所以其对Bcl-2的亲和力相对较差并不奇怪。考虑到Bcl-2也在人类癌症中广泛过表达，且Bcl-2过表达与非霍奇金淋巴瘤的发生高度相关，研究人员希望拓宽化合物对Bcl-2的高亲和力。
Bcl-xL和Bcl-2的三维结构非常相似，Bcl-2与BH3肽的结合沟槽与Bcl-xL相比只有三个主要残基的差异：104（Bcl-xL和Bcl-2分别为Ala和Asp）、108（Bcl-xL和Bcl-2分别为Leu和Met）和122（Bcl-xL和Bcl-2分别为Ser和Arg），但前者明显更宽。值得注意的是，与Bcl-xL中刚性的L108相比，Bcl-2中具有柔性侧链的M108可以结合到沟槽的更深处。考虑到这
一差异以及Bcl-2沟槽本身较宽，推测进入沟槽更内部的深疏水口袋可能会显著增强抑制剂对应Bcl-2的亲和力。基于此，研究人员从73R出发，通过基于结构的优化寻有效的双Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。
再次优化site1
通过解析73R的苯并噻唑类似物80与Bcl-xL和Bcl-2结合的NMR结构（图6），研究人员发现80采用了沿蛋白质疏水性表面延伸的构象，且site 1末端明显有未与抑制剂相互作用的口袋。这表明取代抑制剂在1位点末端有可能增强对Bcl-2的结合亲和力，而不影响对Bcl-xL的亲和力。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议