发酵工程与设备
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木瓜蛋白酶
摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。
Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries
关键字：木瓜蛋白酶 化学修饰 酶活力 固定化 行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications
木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白至浅黄的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无或淡黄，有时呈乳白；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异 性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。
一、木瓜蛋白酶的制备及保存
木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即为粗制酶，其水溶液呈混浊状，然后在通过离心去杂的上清液中加入硫酸铵,分级分离得沉淀，加入半胱氨酸溶液后经盐析重结晶干燥得精制酶，木瓜蛋白酶室温贮存活力稳定性与活力高低呈反比，正常使用时造成活力下降的主要因素为干燥失重(温度和空气氧化，粗制酶比精制酶稳定。热风吹干和喷雾干燥的酶比冷冻干燥的酶稳定。因此酶应存放在低于10摄氏度条件下，为了避免木瓜蛋白酶失活，可以加入适量亚硫酸氢钠。
二、木瓜蛋白酶的化学修饰
由于天然木瓜蛋白酶在高温、重金属离子、极端pH 等条件下, 易遭到破坏, 使酶的生产和使用受到极大的限制。如何提高酶的稳定性、解除抗原性、改变酶学性质、扩大酶的应用范围, 越来越引起人们的重视.酶的化学修饰就是利用化学手段将某些化学物质或基团结
合到酶分子上, 或将酶分子的某些部分删除或置换, 改变酶的理化性质, 最终达到改变酶的催化性质的目的e型钢, 创造出一些天然酶所不具有的优良性能, 提高其生物活性, 增强在不良环境下的稳定性. 近年来, 酶分子化学修饰研究在修饰方法、修饰试剂及修饰酶的性质等方面, 取得了一系列研究成果。
酶的化学修饰是酶工程的一项重要课题. 而通过化学修饰方法得到优质的半合成酶高压水冲, 使它们的性能得到改善, 拓宽它们的应用领域, 也是一个极具挑战性的研究,酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系提供了一些信息. 研究结果表明, 以酸酐类小分子化合物为修饰剂对木瓜蛋白酶进行化学修饰是一种操作简便, 条件温和, 制备效果较好的酶修饰方法.关于酸酐对木瓜蛋白酶的修饰结果相比, 本文采用的修饰剂偏苯二甲酸酐和均苯四甲酸酐对木瓜蛋白酶进行化学修饰后, 使修饰木瓜蛋白酶结合了更多的羧基官能团, 从而在热稳定性、耐碱性和耐洗涤剂方面显示优良的性能.
三、木瓜蛋白酶酶活力的影响
影响酶活力测定的因素很多，主要有温度、pH 和底物浓度等。
1、温度对酶活力测定的影响
每一种酶在一定条件下，只有在某一个温度下表现出最大活性，即所谓最适温度。但它也会受其它条件如底物作用时间和pH 的影响而改变。当其他规定条件不变时，温度改变1℃，反应速度可相差10%以上。通过试验，木瓜蛋白酶的适宜温度为60±0.2℃，所以，反应必须在恒温槽内进行，并且所有试剂在反应开始前进行预热。
2、pH 对酶活力测定的影响
酶的活性与作用底物的氢离子浓度有很大关系。不同的酶都有不同的最适pH 和所需要的缓冲液。同一种酶在不同的pH 时测定的活性不同。只有在某种缓冲液和某种pH 范围内才表现出最大活性，即所谓最适pH，一般认为酶分子处在最适pH时，其活性基团解离状态最易与酶和底物结合，酶和底物结合减弱，活性就降低。pH 对酶稳定性影响很大，在最适pH 的一侧或两侧都可能导致酶的不可逆破坏。通过试验，木瓜蛋白酶的最适伸缩车棚pH 为7.0sata连接器。
3、 底物浓度对酶活力测定的影响
在酶活性测定中，底物纯度和浓度是十分重要的因素，要求底物尽可能纯化。在测定木瓜蛋白酶时，规定选用上海乳品一厂出品的生化纯（B.R）酪素。
底物浓度是决定酶反应速度的因素。在低的底物浓度时，底物浓度增加，反应速度随着增加，反应速度与底物浓度成正比。当底物浓度增高时，增加底物浓度，反应速度虽随之增加，但它不再与底物浓度成正比。当底物浓度增加到一定程度以后，反应速度不受底物浓度的影响而趋于恒定，达到了测定酶活性时底物要过量的要求。
4、 酶浓度对酶活力测定的影响
在一定条件下，假定底物浓度为饱和量时，反应速度与酶浓度成正比，这时，反应速度与底物浓度无关，即零级反应。测定活性用的酶应尽可能纯化，但是工业用的酶制剂难以达到高纯度。
为避免由于微量杂酶的存在而引起的反应，尽可能用低浓度的待测酶液，同时还应注意以下两点：（1）做好待测酶液的制备。精确称取酶粉1.0000~2.0000g，用少量缓冲液于37℃溶解，用玻璃棒捣研微波合成萃取仪3~4 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，再用4 层纱布过滤，其滤液供测定用。如果在制备过程中，没有充分将酶粒捣研开或过滤不当都将造成误差；（2）当其他条件恒定以后，一定要控制好待测酶液的用量。测定木瓜蛋白酶，通常OD 值控制在0.2~0.4 之间。立方氮化硼砂轮
四、木瓜蛋白酶的固定化及方法
固定化酶的研究发展迅速,人们已经先后进行多种固定化方法研究。酶的固定化方法主要有:吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。这些方法各有利弊。载体材料作为固定化酶的重要部分,其结构和性能对固定化酶的酶学性质产生很大的影响。因此很多学者一直致力于对载体的研究,以求获得适于某种酶的价格低廉的载体、操作简便和酶活力回收更高的固定化方法。
前人利用海藻酸钠进行固定化酶,由于海藻酸钠钙化后小球硬度不够, 装柱时易变形,较易溶解,本试验在海藻酸钠中加入壳聚糖粉末, 小球硬度明显提高;此方法还未见报道。本文利用此改进的包埋法来制备固定化木瓜蛋白酶 ,与尼龙布的共价键结合法固定化木瓜蛋白酶进行比较,并对其性质进行研究。
传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。改善酶固定化效果的途径有：改善表面积以及孔径等物理结构，如采用分子筛或纳米纤维微孔膜；改善化学交联的反应及方式，如辐照，引发剂引发等；改善结合的方向选择性，如采用定向固定化的方法；其他手段，如利用长臂使酶远离载体表面，使载体一酶体系的溶解度随温
度、pH值等条件的改变而改变，以便于产物的分离及酶的回收。
1、包埋法固定
包埋法:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法。凝胶包埋法是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。
1.1海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶
海藻酸是从褐藻提取的,是甘露糖醛酸以β-1, 4键相连接的多糖类物质,它是包埋酶较为理想的载体,其固定化方法较为简单,条件温和,操作可在室温下进行,酶很少失活。但是,海藻酸钙凝胶在含多价阴离子(磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐等) 的溶液以及高浓度电解质( K+ , Na+) 溶液中不稳定,Ca2 +离子易脱落,凝胶变软,甚至溶解。在研究海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶时一方面在制作凝胶时使用Tris盐酸缓冲液,减少Ca2 +离子的脱落,保持凝胶的稳定;另一方面首次通过加入壳聚糖粉末来提高凝胶硬度,壳聚糖上的正电荷(- NH+3)与海
藻酸的羧基相互作用,起到稳定凝胶的作用,适用于装柱使用,与不加壳聚糖粉末的固定化酶酶活性相同。
1.2壳聚糖胶囊法固定化木瓜蛋白酶
壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种生物高分子物质,又名脱乙酰甲壳质。壳聚糖作为固定化酶载体具有化学性质稳定、耐热性好等优点,是固定化酶的良好载体。采用壳聚糖与羧甲基纤维素钠复凝聚形成胶囊将木瓜蛋白酶固定化,确定酶固定的最佳条件为:给酶量为500mg/10mL ,壳聚糖浓度为0.2%、pH值为7.5、温度为50℃,所得固定化木瓜蛋白酶活力回收率最高可达69.8%。
2、吸附法固定
吸附法:利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。吸附法制备固定化酶,操作简便、条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价
廉易得,而且可反复使用。由于靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固、易脱落,
所以在实际生产中运用较少,这方面的研究也较少。
冷冻- 真空吸附法在介孔材料中固定木瓜蛋白酶。介孔分子筛孔道里组装功能材料的方法有多种, 常见的有气相吸附、浸渍法等, 与普通吸附方法相比, 冷冻- 真空吸附法是一种新的方法, 其优点为: 一是驱动力大, 吸附蛋白量会更大; 二是在低温状态下可保持酶蛋白的活性。
3、共价偶联法固定
共价偶联法:利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法,也叫共价结合法。共价结合法是目前研究最活跃的固定化方法之一。它的优点在于酶与载体结合牢固,不易脱落,可以连续使用较长时间。但也存在以下缺陷: (1) 在固定化过程中酶分子与载体分子之间发生直接(刚性) 碰撞,易使酶的构象改变,使酶失活; ( 2) 载体一般是疏水性物质,当酶直接被固定在疏水载体上时会改变酶的微环境,使酶蛋白构象发生折叠、失活; (3) 传统共价结合法得到的固定酶自由度低,酶分子和底物之间存在较大空间位阻,不利于保留酶游离态的均相催化活性。故称之为"刚性固定化"。共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
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