肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）对子宫颈癌细胞脂质代谢的作用 郝立君 1），徐丽秀 2），李金秋 2），马俊旗 3），阿仙姑·哈斯木 2）
（1）新疆维吾尔自治区人民医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830001；2）新疆医科大学基础医学院，
新疆 乌鲁木齐 830011；3）新疆医科大学第一附属医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830011）
[ 摘要 ] 目的 探讨肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）蛋白对宫颈癌细胞脂质代谢的作用。方法 应用免疫组织化学方法检测Pinl 和ACC1蛋白在女性慢性宫颈癌及宫颈癌组织的表达；Western blotting 技术和RT-PCR 技术检测Pin1基因在宫颈癌SiHa、C33a 及H8细胞中的蛋白本底表达情况，采用RNA 干扰技术下调子宫颈癌C33a 细胞中Pin1的表达；Western blotting 技术检测宫颈癌细胞中Pin1蛋白表达水平变化对ACC1蛋白表达的影响；脂溶性荧光染（BODIPY493/503）观察转染Pin1低表达慢病毒前后宫颈癌细胞中性脂肪含量的变化。结果 与慢性宫颈炎相比，宫颈癌组织中Pin1和ACC1蛋白表达明显上调（P < 0.05），两者在宫颈癌组织中的表达呈正相关（χ2 = 6.02，P < 0.05）。与C33a 细胞相比，SiHa 细胞中Pin1蛋白的表达水平较低，故选用C33a 细胞转染Pin1低表达慢病毒。C33a 细胞转染Pin1低表达慢病毒后，Pin1及ACC1蛋白表达水平明显降低（P <0.05），与正常对照组和阴性对照组比，转染Pin1低表达慢病毒的细胞内中性脂肪酸含量降低。结论 Pin1蛋白的表达参与宫颈癌细胞内的脂质代谢，具体调控机制尚待研究。 天文圆顶
[ 关键词 ] 宫颈癌； 肽基脯氨酰同分异构酶； 脂肪酸合成酶
[ 中图分类号 ] R737.33 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 2095 − 610X （2021）01 − 0012 − 05
The Effect of Peptide-prolinyl Isomerase （Pin1）on Lipid
Metabolism in Cervical Cancer Cells
HAO Li-jun 1），XU Li-xiu 2），LI Jin-qiu 2），MA Jun-qi 3），AXIANGU Hasimu 2）
（1） Dept. of Laboratory ，People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region ，Urumqi Xinjiang 830001; 2） Basic Medicine College of Xinjiang Medical University ，Urumqi Xinjiang
830011; 3） Dept. of Gynecology ，The 1st Affiliated Hospital of Xinjiang
Medical University ，Urumqi Xinjiang 830011，China ）
［Abstract ］ Objective To investigate the effect of peptide-based prolinyl isomerase （Pin1）protein on lipid metabolism in cervical cancer cells. Methods The expression of Pinl and ACC1 protein in chronic cervical cancer and cervical cancer tissues was detected by immunohistoche
mistry. Western blotting and RT-PCR were used to detect the background expression of Pin1 gene in SiHa，C33a and H8 cells of cervical cancer，and RNA interference was used to detect the expression of Pin1 in C33a cells of cervical cancer. The influence of Pin1 protein expression on ACC1 protein expression in cervical cancer cells was detected by Western blotting. Lipid-soluble fluorescence staining （bodipy493/503）was used to observe the changes in the content of neutral fat in cervical cancer cells before and after transfection with low expression of lentivirus Pin1. Results Compared with chronic cervicitis，the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was significantly up-regulated （P < 0.05），and the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was positively correlated （r = 4.45， P < 0.05）. Compared with C33a cells，the expression level of Pin1 protein in SiHa cells was relatively low，so C33a cells were selected for transfection with lentivirus with low Pin1 expression. After the transfection with lentivirus with low Pin1
[收稿日期] 2020 − 11 − 26
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81960463）
[作者简介] 郝立君（1979～），男，新疆乌鲁木齐人，医学学士，副主任技师，主要从事临床医学检验工作。[通信作者] 阿仙姑·哈斯木，E-mail ：*****************
昆明医科大学学报 2021，42 （1 ） ：12~16Journal of Kunming Medical University
DOI: 10.12259/j.issn.2095-610X.S2*******
CN 53 − 1221/R
expression in C33a cells，the protein expression levels of Pin1 and ACC1 were significantly decreased（P < 0.05）. Compared with normal control group and negative control group，the content of intracellular neutral fatty acids transfected with lentivirus with low Pin1 expression was decreased. Conclusion The expression of Pin1 protein is involved in lipid metabolism in cervical cancer cells，and the specific regulatory mechanism remains to be studied.
［Key words ］ Cervical cancer；Peptide-prolinyl isomerase；Fatty acid synthetase
肽基脯氨酰同分异构酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，Pin1）是肽基脯氨酰同分异构酶家族成员之一，可以特异性结合于磷酸化的丝－脯氨酸残基或苏－脯氨酸残基位点，并催化磷酸化的丝/苏氨酸基序发生构象改变，由顺式变为反式或由反式变为顺式，从而改变底物蛋白质的功能，这种改变主要关系到细胞增殖和转化[1−2]。最近研究发现，乳腺癌细胞中Pin1调节EGF信号通路，从而增加甾醇调节元件结合蛋白- 1c的启动子活性，导致脂肪酸合成关键酶的过表达，促进肿瘤细胞侵袭和迁移[3]。
本研究选择女性慢性宫颈炎和宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）患者的石蜡包埋组织标本及宫颈癌细胞系，检测Pinl和脂肪酸合成酶（（fatty acid synthase，ACC）蛋白表达水平，并分析Pinl蛋白表达变化对宫颈癌细胞脂肪酸含量的改变，探讨Pinl过表达对宫颈癌细胞脂肪酸代谢的调控作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
收集2015年10月至2018年12月在新疆医科大学第一附属医院妇科收治的慢性宫颈炎和CSCC手术或活检获得的石蜡包埋组织94例，所有标本术前均未接受过放化疗或其他特殊处理且入组前均由病理科医师确诊。其中慢性宫颈炎组织30例，宫颈癌组织64例，年龄27～58岁，中位年龄（37.68±6.00）岁；所有患者的临床病理学资料收集前均征得患者本人及家属同意，并签署知情同意书。实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准通过。结构光三维扫描仪
1.2 材料
1.2.1 细胞系 SiHa、C33a及H8细胞均购买自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2.2 试剂 免疫组织化学SP检测试剂盒和DAB显试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司产
品；鼠抗人Pinl和ACC1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司产品；Western blotting试剂盒（美国Thermo公司）；反转录试剂盒（美国Thermo公司）；PCR试剂盒（中国康为世纪科技有限公司）；BODIPY493/503染液（美国Thermo公司）。
1.3 方法
1.3.1 免疫组织化学法 对石蜡包埋的组织标本进行连续3 um厚的切片，切片经常规脱蜡、水化和微波抗原修复，按免疫组织化学SP检测试剂盒说明书，加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，加1：500稀释的鼠抗人Pinl和ACC单克隆抗体（美国Santa Cruz公司产品），4 ℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗，37 ℃培育1 h；加入DAB显，苏木精复染。显微镜下观察，随机选取5个视野拍照。
1.3.2 采用Western blotting方法 提取细胞内的总蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行浓度测定。蛋白样品电泳分离后，在100 V 稳压电压下电转至PVDF膜上，随后封闭液室温封闭，一抗孵育，4 ℃过夜，二抗孵育，采用ECL法显，拍照，灰度值扫描，与内参GADPH 进行比较，计算出Pinl蛋白的相对表达量。数据重复3次实验所得。
1.3.3 RT-PCR技术 使用Trizol法提取细胞内总mRNA，按照反转录试剂盒制备cDNA，PCR 反应体系如下：预变性94 ℃，2 min；94 ℃，40 s→60 ℃，30 s→72 ℃30 s（35个循环扩增）。Pin1引物
序列如下，正义链GATCAACGGCTACAT CCACAA；反义链GGCGTCTTCAAATGGCTTC。1.3.4 Pinl低表达慢病毒转染C33a细胞 取1×104个细胞孔接种于6孔板中，次日，弃上清，加入1 mL转染工作液（按照吉凯基因公司说明书配比），病毒浓度按MOI = 30添加至工作液中。转染72 h，在荧光倒置显微镜观察荧光表达。shPin1序列如下，shPin1：GCCATTTGAAGACGCCT CGTT。
1.3.5 脂溶性荧光染（BODIPY493/503） 检测细胞内中性脂肪含量 收集1×105个细胞接种于激光共聚焦小皿中，培养24 h后，PBS洗去残余培养基后使用4%甲醛固定细胞，室温，30 min；加入稀释好的BODIPY493/503染液，避光30 min；随后将DAPI染液添加进上清液中，室温10 min；
第 1 期郝立君， 等．肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）对子宫颈癌细胞脂质代谢的作用13
激光共聚焦显微镜下观察染情况并随机选取5个视野进行拍照。
1.4 统计学处理
¯x
实验数据由SPSS 23.0软件进行统计学分析，计数资料采用卡方检验进行比较；计量资料采用
均数±标准差（±s ）描述；若为计量资料且服从正态分布，多组之间采用单因素方差分析进行比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。以上所有实验均重复3次以上。
2 结果
2.1 Pinl 在宫颈病变组织以及宫颈正常组织中的表达
免疫组织化学方法检测慢性宫颈炎及宫颈癌组织中Pinl 和ACC1蛋白的表达情况。结果表明，Pinl 在宫颈鳞癌组织中阳性表达率92.18%（59/64）明显高于正常宫颈组织30%（9/30），差异具有统计学意义（P < 0.001），见图1，表1。ACC1在宫颈鳞癌组织中阳性表达率78.13%（50/64）明显高
于正常宫颈组织36.67%（11/30），差异具有统计学意义（P < 0.001）。进一步分析宫颈癌组织中Pinl 和ACC1蛋白表达相关性，结果可知，宫颈癌组织中Pinl 和ACC1蛋白的表达呈正相关（χ2 =6.02，P < 0.05），见表2。
2.2 Pinl 在宫颈鳞癌细胞以及正常宫颈细胞中的
下变频器表达
经Western-blotting 技术检测，在宫颈癌细胞SiHa、C33a 和正常宫颈上皮细胞H8三株细胞中Pinl 蛋白表达水平不同，其在H8、SiHa 和C33a 中表达水平分别为（0.438±0.165）、（0.814±0.197）、（1.34±0.386）（P < 0.001），见图2，由于Pinl 在C33a 细胞的蛋白及mRNA 表达量高，SiHa 细胞的表达量低，见图3、表3，因此，选
用C33a 细胞转染shPin1慢病毒。
2.3 C33a 细胞转染shPin1慢病毒后Pin1蛋白
表达的变化
通过shPin1慢病毒稳定转染C33a 细胞，经过嘌呤霉素筛选，分选出稳定转染shPin1的细胞株，经过Western blotting 实验检测Pin1的表达情况，结果显示在C33a 细胞中，shPin1组细胞Pin1蛋白的相对表达量（0.435 6±0.105 51）显著低于shNON 组（0.617±0.153 4）和C33a 组（0.585±0.181 4）中Pin1蛋白的相对表达量（P < 0.05）。表明shPin1慢病毒转染C33a 细胞成功。而ACC1蛋白在shPin1组（0.109±0.066 2）较shNON 组（0.310 7±0.012）和C33a 组（0.322±0.014）明显表达降低，见图4。
2.4 宫颈癌细胞内中性脂肪含量的改变
采用BODIPY493/503染的方法检测宫颈癌细胞内中性脂肪水平的变化情况。结果显示，相
Pin1
ACC1
A C
B D
宫颈癌组织
正常宫颈组织
图 1 Pin1和ACC1蛋白在两种宫颈病变组织中的表达
情况（×200）
Fig. 1 The expression of Pin1 and ACC1 protein in two
cervical lesions
A、B：宫颈癌组织；C、D：正常宫颈组织。
表 1 Pinl 和ACC 蛋白在宫颈相应组织中的表达情况[n （%）]
Tab. 1 The expression of Pinl and ACC proteins in corresponding cervical tissues [n （%）]
分类
n Pin1
ACC1
阳性χ2P 阳性χ2P 慢性宫颈组织309（30）94.471
0.000 0
压花辊11（36.67）45.274
0.000
CSCC 组织
64
卡口摄像头59（92.18）*
50（78.13）*
与慢性宫颈炎组织比较，*P < 0.05。
表 2 Pin1与ACC1表达水平的相关性分析
Tab. 2 Correlation analysis of expression levels of Pin1
and ACC1Pin1ACC1χ2P +−+1045 6.02
0.014
−
5
4
14昆明医科大学学报
第 42 卷
较于shNON 组，shPin1组中的中性脂肪含量明显降低，见图5。实验结果表明Pin1能够促进宫颈癌细胞内的中性脂肪含量。
3 讨论
据2018年最新的统计数据，我国宫颈癌是仅
GADPH
A
B
C33a
*
SiHa H8
C33a
SiHa H8
2.01.51.00.50
图 2 Pin1蛋白在3株细胞中的表达情况Fig. 2 The expression of Pin1 protein in 3 cell lines A：Pin1的Western blotting 结果；B：Pin1蛋白相对表达量。
与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
Pin1
GADPH
A
B
2.0
1.51.00.5
*
C33a
SiHa
H8
C33a
SiHa H8
图 3 Pin1 mRNA 在3株细胞中的表达情况Fig. 3 The expression of Pin1 mRNA in 3 cell lines A：Pin1的PCR 结果；B：Pin1mRNA 相对表达量。
与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
¯x ±s 表 3 宫颈癌细胞中Pin1 mRNA 的相对表达量（）
¯x ±s Tab. 3 The relative expression of Pin1 mRNA in cervical cancer cells （）
基因名
H8
SiHa C33a F P Pin1
0.17 ± 0.069*
1.0 ± 0.67
1.43 ± 0.26
91.997
0.000
与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
C33a
shNON
无菌检测系统shNON shPin1
shPin1
Pin1
ACC1
A
B
C33a 1.00.80.60.40.20
*
*
图 4 干扰Pin1后宫颈癌细胞中Pin1和ACC1蛋白表达情况
Fig. 4 The expression of Pin1 and ACC1 protein expression in cervical cancer cells after down regulate Pin1
A：Pin、ACC 的Western blotting 结果；B：Pin、ACC 蛋白相对表达量。
与C33a 细胞比较，*P < 0.05。
第 1 期郝立君， 等．肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）对子宫颈癌细胞脂质代谢的作用
15
次于乳腺癌居第2位的妇科恶性肿瘤[3]。新疆地区维吾尔族妇女宫颈癌发病率高，死亡率高，中晚期患者较多[4]，被列为新疆特高发肿瘤之一。恶性肿瘤的转移机制非常复杂，包括维持增殖信号、能量代谢的重新编程、诱导血管生成、逃避免疫监视、肿瘤微环境创建等[4−5]。Pin1代表着一种新的磷酸化后调节机制，是多种致癌信号途径激活的关键催化剂。蛋白质分子在其脯氨酸前的丝/苏氨酸模体（pSer/Thr-Pro motifs ）的磷酸化是一种重要的信号调节机制，参与许多细胞生物学进程，一旦干扰了这条信号通路将会导致细胞恶性转化及癌症的发生。
由Pin1所催化的蛋白构象变化能对许多磷酸化信号途径产生影响，在不同的细胞进程中发挥着重要作用，对人类恶性肿瘤的发生发展具有重要意义[6]。研究发现，Pin1与多种人类肿瘤具有一定相关性。如，Pin1的mRNA 和蛋白水平在人乳腺癌、肝癌和食管癌等组织高表达，并与淋巴结转移密切相关[7]。在乳腺癌细胞系中Pin1磷酸化SHC 上苏氨酸残基并促进其与配体结合，激活能量感受器AMPK 分子与AKT 途径的交叉作用，促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移[8]。近期研究者应用砷靶向阻断Pin1，与维甲酸协同抑制肿瘤的驱动途径和肿瘤起始细胞[9−10]。
最近研究发现，肿瘤细胞中Pin1调节丙酮酸激酶亚型M2（PKM2）和磷酸甘油酸激酶1（PGK1），从而增加增强该蛋白核移位或线粒体移位，导致Warburg 效应和活性氧（ROS ）生成减少[11]。也有研究报道，Pin1与脂肪生成的主要调节因子PPARγ相结合，并增强PPARγ的转录活性，从而导致脂肪生成。以上研究结果提示，Pin1分子可能参与了肿瘤细胞代谢重编程[12]。课题组将在宫颈癌细胞及动
物模型中进一步研究Pin1对脂肪酸合成通路关健酶ACC 和脂肪酸β氧化的关键酶CPT1的调控分子机制。
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［12
］A B
图 5 干扰Pin1基因后宫颈癌细胞内中性脂肪含量Fig. 5 Neutral fat content in cervical cancer cells after
down regulate Pin1
A：shNON；B：shRACK1。
16昆明医科大学学报第 42 卷
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