鸦胆子苦素D抑制TNF-α作用下CAFs促三阴性乳腺癌转移的应用

鸦胆子苦素d抑制tnf-α
作用下cafs促三阴性乳腺癌转移的应用
技术领域
1.本发明涉及一种鸦胆子苦素d抑制tnf-α作用下cafs促三阴性乳腺癌转移的应用，属于肿瘤药物开发技术领域。

背景技术：

2.乳腺癌作为全球女性的高危恶性肿瘤之一，其死亡率位居全球女性恶性肿瘤首位。缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，tnbc)，作为乳腺癌最具侵袭性的亚型之一，因其早期易转移、术后易复发等临床特点，导致该乳腺癌亚型患者预后差、死亡率高。尽管部分tnbc患者对以蒽环类、紫杉类及铂类配合物为主的化疗方案较为敏感，但因肿瘤自身病理特征的复杂性仍有一些患者临床反应性较差，且易出现多种毒副反应及耐药现象，严重影响患者的生存及预后。研究显示，远处脏器转移是tnbc患者及预后不甚理想的重要原因。因此，如何控制这一强侵袭性乳腺癌亚型肿瘤细胞转移，从而改善tnbc患者预后是临床亟待解决的难题。
3.近年研究证实，肿瘤的进展受肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)的重要调控，并不完全依赖于肿瘤细胞的自主缺陷。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，cafs)作为“肿瘤伤口愈合”的解药，在慢性组织损伤的微环境状态下主要由正常成纤维细胞或间充质干细胞等活化或转分化而来。cafs作为肿瘤微环境中主要基质细胞组分，通过细胞间的接触调节肿瘤细胞和其它基质细胞的生物学行为，释放大量的调节因子，合成和重塑细胞外基质，从而影响肿瘤的发生和发展。
4.研究显示，慢性炎症被认为是恶性肿瘤的重要生物学特征。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，tnf-α)是乳腺癌微环境中发现的一种重要的促炎细胞因子，参与肿瘤发生发展的各个阶段，并且在肿瘤转移中起重要作用，它可被tme中多种细胞所分泌，如肿瘤相关巨噬细胞、基质细胞及癌细胞等，诱导其它炎性细胞因子和趋化因子的级联反应，扩大肿瘤微环境中慢性炎症的产生。临床实验表明，乳腺癌患者血清中tnf-α的含量与临床分期呈正相关。且有研究显示，肿瘤微环境中的tnf-α可增强基质细胞与肿瘤细胞间的交互对话，加快肿瘤细胞的增殖和远端转移。
5.中药鸦胆子为苦木科植物鸦胆子的成熟果实，主产于两广等地，其性味苦、寒，具有清热解毒、截疟、止痢、腐蚀赘疣等功效。鸦胆子苦素d属于苦木内酯类化合物，该类化合物为鸦胆子属植物的标志性次生代谢产物，同时也是鸦胆子中主要的化合物。研究发现，鸦胆子苦素d可通过促进癌细胞凋亡，降低胞内谷胱甘肽水平，阻碍炎症级联放大，抑制癌细胞侵袭迁移等方式发挥抗癌作用。然而，鸦胆子苦素d能否削弱炎症介质tnf-α作用下cafs促肿瘤细胞转移并遏制小鼠原位肿瘤向远端器官(肺/肝)的转移作用尚未有人报道，因此，有必要研究鸦胆子苦素d的上述应用。

技术实现要素：

6.本发明的目的是提供鸦胆子苦素d抑制tnf-α作用下cafs促三阴性乳腺癌细胞转移及抑制小鼠自发性“乳腺原位-肺/肝”肿瘤转移。
7.本发明首先提供鸦胆子苦素d在制备预防和/或乳腺癌的药物中的应用。
8.本发明还提供了鸦胆子苦素d在制备预防和/或侵袭性/转移性乳腺癌的药物中的应用。
9.所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
10.所述侵袭性/转移性乳腺癌包括乳腺癌的局部浸润与远端转移；
11.所述乳腺癌的局部浸润与远端转移为tnf-α作用下cafs促进的乳腺癌细胞的侵袭与转移；
12.所述乳腺癌细胞为mda-mb-231或4t1；
13.所述远端转移为肝转移；
14.所述远端转移为肺转移。
15.本发明进一步提供了鸦胆子苦素d在制备预防和/或乳腺癌转移灶的药物中的应用；
16.所述乳腺癌转移灶为肝转移灶和/或肺转移灶。
17.鸦胆子苦素d在下述任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
18.1)制备抑制乳腺癌细胞生长并促进其凋亡的药物；
19.2)制备抑制乳腺癌细胞侵袭与迁移的药物；
20.3)抑制乳腺原位-肺肿瘤转移灶的形成的药物；
21.4)抑制乳腺原位-肝肿瘤转移灶的形成的药物；
22.5)降低血清中tnf-α含量的药物；
23.6)降低乳腺肿瘤组织中tnf-α蛋白含量和cafs标志物α-sma的表达的药物；
24.7)降低乳腺肿瘤组织中mmp2、mmp9以及胶原蛋白的表达的药物。
25.本发明采用tnf-α刺激cafs与三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231与4t1)共培养体系，构建体外共培养促三阴性乳腺癌细胞转移模型及体内cafs/4t1共培养下小鼠自发性乳腺“原位-肺/肝”肿瘤转移模型，并探究鸦胆子苦素d抑制cafs促三阴性乳腺癌侵袭与转移的作用。通过本发明为鸦胆子苦素d有效防治三阴性乳腺癌的局部浸润与远端转移以及作为在防治三阴性乳腺癌的药物开发提供实验数据支撑。
附图说明
26.图1为鸦胆子苦素d对mda-mb-231及4t1细胞生长的影响。
27.图2为鸦胆子苦素d(bd)对tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231/cafs+4t1”共培养细胞迁移与侵袭能力的影响。
28.图3为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤的影响，其中，图3a为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤的影响(n＝6)；图3b为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤重的影响(n＝6)；图3c为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤病理学分析(n＝3)；图3d：鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤ki67蛋白的影响(n＝3)。
29.图4为鸦胆子苦素d对小鼠肺/肝转移的影响，其中，图4a、图4b为鸦胆子苦素d对小
鼠肺转移结节的影响(n＝6)；图4c为鸦胆子苦素d对小鼠肺/肝转移灶的影响。
30.图5为鸦胆子苦素d对小鼠血清中tnf-α含量的影响(n＝6)。
31.图6为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中tnf-α及cafs标志物表达的影响，其中，图6a为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中tnf-α的影响(n＝3)；图6b为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中cafs标志物α-sma的影响(n＝3)；图6c为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中tnf-α及cafs标志物α-sma共定位表达的影响(n＝3)。
32.图7为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中mmp2、mmp9以及胶原蛋白表达的影响，其中，图7a为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织cafs分泌的mmp2、mmp9的影响(n＝3)；图7b为鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中cafs分泌胶原蛋白的影响(n＝3)。
具体实施方式
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
34.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例1、鸦胆子苦素d抑制tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231/4t1”共培养细胞增殖及侵袭与迁移能力研究
36.1.实验方法
37.1.1实验试剂及试药配制
38.1.1.1含15％fbs细胞培养基
39.在50ml无菌离心管中先加入42.5ml dmem/f12培养基，然后向中加入7.5mlfbs和500μl青霉素、链霉素混合液，混匀后4℃保存备用。
40.1.1.2含10％fbs细胞培养基
41.在50ml无菌离心管中先加入45ml dmem培养基，然后向中加入5ml fbs和500μl青霉素、链霉素混合液，混匀后4℃保存备用。
42.1.1.3鸦胆子苦素d储备液
43.精密称取5.47mg鸦胆子苦素d溶于20μl的dmso中，配成667mm/l的储备液于-20℃保存备用。
44.1.1.4tnf-α溶液
45.将10μg的tnf-α离心(10000rpm/min，1min)后，在超净工作台中加入100μl溶解液自然溶解，加入900μl的稀释液(含5％海藻糖的pbs)，混匀后即得10μg/ml的tnf-α溶液，于-20℃保存备用，不可反复冻融。
46.1.2实验细胞培养
47.1.2.1细胞株的复苏
48.mda-mb-231细胞及4t1细胞均购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将冻存的mda-mb-231或4t1细胞从液氮罐中取出，于37℃水浴中快速晃动使其快速溶解。预先于4ml离心管中加入2ml含血清的培养基，然后将细胞转移至此离心管中吹打混匀，离心(1000rpm/min、5min)后去除上清液，加入新鲜培养基吹打为细胞悬液并接种于100mm3培养皿中，37℃、5％co2的培养箱中培养。
49.1.2.1细胞株的培养及传代
50.待复苏的细胞株生长1～2天后，弃去原培养基，1ml的pbs清洗两遍后加入新鲜培养基。待细胞生长密度达到85％时，1ml的pbs清洗两遍后加入1ml胰蛋白酶消化细胞。当在显微镜下观察到细胞触角收缩，形态变圆，间隙增大，成单个细胞分散时，立即加入2ml新鲜培养基中止消化，用移液吹打培养皿底部使细胞全部脱落，收集细胞悬液于4ml无菌离心管中，离心(1000rpm/min、5min)后去除上清液，加入新鲜培养基吹打为细胞悬液，按照实验所需密度进行接种，每周更换新鲜培养基2～3次。
51.1.2.3细胞株的冻存
52.按上述消化并离心后收集细胞，加入1ml已配制好的冻存液，混匀后转移至无菌冻存管内，标记细胞名称及冻存日期，封口膜封口后于-80℃梯度降温盒中过夜，转移至液氮罐中长期保存。
53.1.3mtt实验检测鸦胆子苦素d对mda-mb-231及4t1细胞抑制率的影响
54.取对数生长期的mda-mb-231及4t1的细胞悬液并调整浓度为1x105/ml，于96孔板所设定的实验孔中按每孔100μl加入细胞悬液，四周孔加入200μl的pbs。待细胞生长至合适密度时，弃去原培养基，加入不同浓度的鸦胆子苦素d分别处理细胞24h、48h及72h后，弃去含药培养基，每孔加入100μl无血清培养基和10μl的mtt溶液，置于培养箱4h后吸去培养液，并每孔加入150μl的dmso溶液，于酶标仪中37℃、震荡10min后，490nm下测定od值，每次实验均重复3次(细胞抑制率％)＝1-(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)。
55.1.4迁移与侵袭实验检测鸦胆子苦素d对tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231/cafs+4t1”共培养细胞迁移与侵袭能力的影响
56.在24孔板中加入600μl含10％fbs的培养基(dmem:dmem/f12＝3:1)。transwell迁移实验中，将transwell小室置于上边，并取200μl tnf-α作用的肿瘤细胞与cafs共培养细胞(比例10:1)，密度为1
×
105个/ml，加入到transwell小室中，置于培养箱中培养24h。培养结束后，倒去上室培养液，用棉签轻柔擦去上室细胞，将小室置于4％多聚甲醛中固定15min，pbs洗两次，结晶紫染20min。染结束后，pbs洗去多余染液，于显微镜下拍摄transwell小室底部迁移细胞，用image j软件统计迁移细胞数。transwell侵袭实验中，预先将100μl的matrigel胶(matrigel：培养基＝1：30)包被于transwell小室上部，置于培养箱12h后，吸去未凝固的基质胶，后续操作同transwell迁移实验，每次实验重复3次。
57.2.实验结果
58.全部数据应用spss 24.0软件进行分析。计量资料结果均以表示，多样本间数据比较先进行正态性和方差齐性检验，均均符合采用t检验或单因素方差分析。若不符合正态性或方差齐性，采用kruskal-wallis秩和检验，以α＝0.05为检验水准，以p＜0.05认为具有统计学差异。
59.2.1鸦胆子苦素d对mda-mb-231及4t1细胞生长的影响
60.结果显示，随着bd浓度的增加，bd对mda-mb-231及4t1细胞的抑制率逐渐增加，并呈时间-剂量依赖性。由graphpad prism 8.0计算各组ic50值，结果表明，bd对mda-mb-231细胞的ic50值分别37.883μm(24h)、8.146μm(48h)、2.622μm(72h)；bd对4t1细胞的ic50值分别59.305μm(24h)、36.264μm(48h)、22.637μm(72h)。结果见附图1。
61.2.2鸦胆子苦素d对tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231/cafs+4t1”共培养细胞迁移与能力侵袭的影响
62.结果显示，在tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231”共培养细胞模型下给予不同浓度的鸦胆子苦素d后，迁移与侵袭细胞数均减少(p＜0.05)。结果见附图2。
63.3.结论
64.细胞毒性实验中，鸦胆子苦素d对mda-mb-231及4t1细胞的抑制率均呈时间-剂量依赖性。根据抗肿瘤药物药效学指导原则，当药物与人癌细胞株作用48～72h后ic50＜20μg/ml表明其具有抗肿瘤研究价值。根据这一标准，表明鸦胆子苦素d具有一定的研究价值。
65.细胞迁移与侵袭实验中，鸦胆子苦素d抑制tnf-α作用下“cafs+mda-mb-231/cafs+4t1”共培养细胞迁移与能力侵袭，并随着浓度提高迁移与侵袭细胞数减少。
66.虽然体外细胞毒性与迁移侵袭实验能快速经济获得鸦胆子苦素d的抗肿瘤研究价值，但缺乏整体环境下对肿瘤细胞的影响，故建立balb/c小鼠“乳腺原位-肺/肝”肿瘤转移模型，明确鸦胆子苦素d抗三阴性乳腺癌肿瘤转移特性及研究价值。
67.实施例2、鸦胆子苦素d抑制小鼠“乳腺原位-肺/肝”肿瘤转移
68.1.实验材料与方法
69.1.1实验动物
70.购买50只4～6周龄balb/c雌性小鼠，体重16～18g，所有动物于宁夏医科大学动物中心spf级屏障中饲养(伦理号：iacuc-nylac-2021-158)。
71.1.2实验试剂配制
72.1.2.1鸦胆子苦素d储备液配制
73.精密称取8.00mg的鸦胆子苦素d，溶于4ml生理盐水中，摇晃溶解，现配现用。
74.1.2.2鸦胆子苦素d工作液配制
75.如表1所示。
76.表1鸦胆子苦素d工作液
[0077][0078]
1.2.3多西他赛溶液配制
[0079]
将多西他赛注射液由冰箱中取出至室温静置5min。取2ml溶剂注入溶液中，手工倒置混合1min，不能摇动。取0.24ml加到20ml生理盐水中混匀，现配现用。
[0080]
1.3实验试剂及材料
[0081]
1.3.1主要试剂及材料
[0082]
表2主要试剂及材料
[0083][0084]
1.3.2抗体
[0085]
表3抗体
[0086][0087]
1.4balb/c小鼠自发性“乳腺原位-肺”转移模型的建立
[0088]
复苏并培养4t1细胞及4t1与cafs共培养细胞(4t1/cafs为10：1)，调整细胞悬液浓度为1
×
106个/ml，取0.1ml接种于balb/c小鼠倒数第二对乳腺脂肪垫内进行造模。10天后所有小鼠均长出肿瘤并进行随机分组，并按照给药方案腹腔注射给药。(1)正常组：不做任何处理；(2)4t1组：造模后，给予生理盐水/2d；(3)4t1+cafs组：造模后，给予生理盐水/2d；(4)多西他赛组(docetaxel)：3mg/kg/2d；(5)鸦胆子苦素d1：1.5mg/kg/2d；(6)鸦胆子苦素d2：3mg/kg/2d。给药期间每天观察小鼠饮食饮水、毛发及活动情况，记录小鼠体重变化。给药24天后结束实验，各组小鼠眼球取血后脱颈处死，剥离小鼠肿瘤组织，拍照后进行称重，置于4％多聚甲醛固定后进行后续实验。
[0089]
1.5h&e染
[0090]
将组织浸泡于4％多聚甲醛中24h后，梯度酒精依次脱水并于二甲苯中透明，随后制备为石蜡切片。将石蜡切片置于70℃烘箱中烘片2h后，经二甲苯ⅰ及ⅱ各20min，无水乙醇、95％、90％乙醇各5min，80％、70％乙醇各3min，流水冲洗后于苏木素5min，流水冲洗并于盐酸酒精分化数秒，随后于伊红5min，流水冲洗后上行酒精脱水封片。
[0091]
1.6免疫组织化学
[0092]
常规脱蜡复水后将切片置于柠檬酸钠缓冲液中煮沸10min，用免疫组化笔圈出组织。滴加试剂一，37℃孵育10min，pbs洗2min
×
3次。滴加山羊血清，37℃孵育20min，稍洗。一抗孵育，4℃孵育过夜，pbs洗2min
×
3次。滴加试剂二，37℃孵育20min，pbs洗2min
×
3次。滴
加试剂三，37℃孵育20min，pbs洗2min
×
3次。dab显，自来水冲洗后，将苏木素染液均匀滴加于组织上，上行酒精至二甲苯，封片。
[0093]
1.7masson染
[0094]
常规脱蜡复水后切片进入masson a液浸泡过夜。随后切片进入masson a液于65℃孵育30min，水洗30s。切片进入混合液(masson b：massonc体积比1：1，现配现用)浸染1min，流水稍洗。切片经1％盐酸酒精分化1min作用后自来水稍洗，切片入masson d浸染6min。水洗后，入masson e浸泡1-2min，不经水洗直接入masson f液染30s。切片经连续3缸1％冰醋酸漂洗，每缸8s后经连续3缸无水乙醇依次脱水5s、10s、30s，然后经两缸正丁醇依次脱水30s和2min，最后经两缸二甲苯透明，每次5min，随后封片。
[0095]
1.8sirius red staining染
[0096]
常规脱蜡复水后天狼猩红染液滴染1h。流水稍洗，如需必要，0.5％冰醋酸冲洗1～2次。苏木素染液滴染10min后流水冲洗10min，常规脱水透明，中性树脂封片。
[0097]
1.9免疫荧光实验
[0098]
常规脱蜡复水后组织切片放于已经加热的edta抗原修复液中处理20min，自然冷却后置于摇床上用pbs洗5min
×
3次，切片稍干后用组化笔画圈。组织上均匀滴加bsa孵育30min。加第一种一抗于4℃湿盒过夜。加对应的二抗，室温孵育50min。pbs洗后滴加cy3试剂，室温避光孵育15min后，并将组织切片放于edta抗原修复液中于微波炉加热处理20min，自然冷却后置于摇床上用pbs洗。滴加第二种一抗及第二种二抗：同上述一抗方法。滴加fitc试剂，室温避光孵育15min，完成后置于摇床上用tbst洗5min。滴加自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min后将片子浸泡于去离子水中，10min。脱水：上行酒精至二甲苯(同上)dapi复染细胞核后pbs洗，稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片拍照。
[0099]
1.10elisa实验
[0100]
小鼠眼眶取血，经12000r/min、5min离心后取血清放置-20℃冰箱中备用。根据elisa试剂盒说明书进行tnf-α检测。
[0101]
2.实验结果
[0102]
统计方法同上。
[0103]
2.1鸦胆子苦素d对小鼠一般状态及体重变化的影响
[0104]
所有小鼠均造模成功并进行给药。实验期间，正常组小鼠饮食饮水正常，状态良好，体重稳步增长。4t1及4t1+caf组小鼠实验期间均无死亡，前期小鼠活动饮食饮水及毛发均正常，后期随着肿瘤增大小鼠饮食饮水减少，反应迟钝、毛发杂乱、倦卧懒动，而4t1+caf组此现象出现时间早于4t1组。docetaxel组小鼠实验期间均无死亡，体重也无明显变化，个别小鼠异常外其余小鼠活动饮食饮水及毛发均正常。3mg/kg及1.5mg/kg的鸦胆子苦素d组小鼠实验期间未出现死亡，体重也无明显变化，前期小鼠活动饮食饮水及毛发均正常，后期小鼠饮食饮水稍减少，反应稍迟钝、毛发较杂乱，但状态明显优于4t1+caf组小鼠。
[0105]
2.2鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤的影响
[0106]
4t1+cafs组小鼠原位瘤较4t1组大(p＜0.001)，给予docetaxel或1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤重量减小(p＜0.001、p＜0.01、p＜0.01)。见附图3a、b。小鼠原位瘤组织病理学分析发现4t1及4t1+cafs组肿瘤核大而圆，核分裂现象明显。而给予docetaxel或1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，肿瘤出现不同程度坏死、空泡凋亡显著
高于4t1+cafs组(p＜0.05)，并且小鼠原位瘤组织ki67阳性表达减小(p＜0.001、p＜0.01、p＜0.01)，见图3d。以上结果表明，3mg/kg及1.5mg/kg的鸦胆子苦素d可以抑制小鼠原位瘤生长，并促进其坏死凋亡。
[0107]
2.3鸦胆子苦素d对小鼠肺/肝转移的影响
[0108]
通过剥离各组荷瘤小鼠肺脏，并对其计数发现，4t1+cafs组小鼠肺结节数为较4t1组多(p＜0.05)，给予docetaxel或1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠肺结节数减少(p＜0.05、p＜0.05、p＜0.01)。见图4a、图4b。对各组荷瘤小鼠肺脏和肝脏进行病理学分析发现，4t1+cafs组小鼠肺/肝肿瘤转移灶较4t1组多，给予docetaxel或1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠肺/肝肿瘤转移灶减少，表明鸦胆子苦素d可以显著抑制荷瘤小鼠的“乳腺原位-肺/肝”肿瘤转移灶的形成。
[0109]
2.4鸦胆子苦素d对小鼠血清中tnf-α含量的影响
[0110]
通过对各组小鼠血清中tnf-α的检测发现，与正常组相比，4t1组及4t1+cafs组均上升(p＜0.05、p＜0.001)；与4t1+cafs组相比，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠血清中tnf-α的含量均出现不同程度下降(p＜0.05)。表明鸦胆子苦素d可以降低小鼠血清中的tnf-α含量，结果见图5。
[0111]
2.5鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中tnf-α蛋白含量及cafs标志物α-sma表达的影响
[0112]
检测小鼠原位瘤组织tnf-α蛋白后发现，4t1+cafs组小鼠阳性表达高于4t1组(p＜0.01)，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤组织阳性表达减小(p＜0.01、p＜0.001)，结果见附图6a。同时我们检测cafs的标志物α-sma后发现，4t1+cafs组小鼠阳性表达高于4t1组(p＜0.001)，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤组织阳性表达减小(p＜0.01)，结果见附图6b。此外，我们通过α-sma(绿)和tnf-α(红)双免疫荧光发现，tnf-α、cafs同时共存，并且tnf-α弥散分布于整个肿瘤组织中，同时cafs周围也有较多tnf-α分布。并且对不同组别进行分析后发现，4t1+cafs组小鼠阳性表达高于4t1组(p＜0.01、p＜0.05)，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤组织阳性表达减小(p＜0.01、p＜0.01)，结果见附图6c。以上结果表明，鸦胆子苦素d可以同时降低小鼠原位瘤组织中tnf-α蛋白含量和cafs标志物α-sma的表达。
[0113]
2.6鸦胆子苦素d对小鼠原位瘤组织中mmp2、mmp9以及胶原蛋白表达的影响
[0114]
结果显示，4t1+cafs组小鼠mmp2及mmp9阳性表达均高于4t1组(p＜0.05、p＜0.05)，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤组织mmp2及mmp9阳性表达均减小(p＜0.05、p＜0.01)，结果见附图7a。然后分别采用masson染和sirius red staining染对小鼠原位瘤组织胶原蛋白进行检测后发现，4t1+cafs组小鼠胶原容积高于4t1组(p＜0.001、p＜0.001)，给予1.5mg/kg及3mg/kg的鸦胆子苦素d后，小鼠原位瘤组织胶原容积减小(p＜0.01、p＜0.001)，结果见图7b与图7c。以上表明，鸦胆子苦素d可以降低小鼠原位瘤组织中主要由cafs所分泌的mmp2、mmp9以及胶原蛋白的含量。
[0115]
3.结论
[0116]
鸦胆子苦素d抑制了小鼠原位肿瘤的增长及肺/肝肿瘤转移灶的形成，其与鸦胆子苦素d同时减弱了肿瘤组织内促炎因子tnf-α表达及cafs的丰度，抑制了cafs的促瘤功能(mmp2、mmp9及胶原蛋白)密不可分。

技术特征：

1.鸦胆子苦素d在制备预防和/或乳腺癌的药物中的应用。2.鸦胆子苦素d在制备预防和/或侵袭性/转移性乳腺癌的药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述侵袭性/转移性乳腺癌包括乳腺癌的局部浸润与远端转移。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌的局部浸润与远端转移为tnf-α作用下cafs促进的乳腺癌细胞的侵袭与转移。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述远端转移为肝转移。7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述远端转移为肺转移。8.鸦胆子苦素d在制备预防和/或乳腺癌转移灶的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌转移灶为肝转移灶和/或肺转移灶。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。11.鸦胆子苦素d在下述任一种中的应用：1)制备抑制乳腺癌细胞生长并促进其凋亡的药物；2)制备抑制乳腺癌细胞侵袭与迁移的药物；3)抑制乳腺原位-肺肿瘤转移灶的形成的药物；4)抑制乳腺原位-肝肿瘤转移灶的形成的药物；5)降低血清中tnf-α含量的药物；6)降低乳腺肿瘤组织中tnf-α蛋白含量和cafs标志物α-sma的表达的药物；7)降低乳腺肿瘤组织中mmp2、mmp9以及胶原蛋白的表达的药物。

技术总结

本发明公开了鸦胆子苦素D抑制TNF-α作用下CAFs促三阴性乳腺癌转移的应用。本发明提供了鸦胆子苦素D在制备预防和/或侵袭性/转移性乳腺癌的药物中的应用，侵袭性/转移性乳腺癌包括乳腺癌的局部浸润与远端转移；乳腺癌的局部浸润与远端转移为TNF-α作用下CAFs促进的乳腺癌细胞的侵袭与转移；远端转移为肝转移或肺转移。本发明采用TNF-α刺激CAFs与三阴性乳腺癌细胞共培养体系，构建体外共培养促三阴性乳腺癌细胞转移模型及体内CAFs/4T1共培养下小鼠自发性乳腺“原位-肺/肝”肿瘤转移模型，并探究鸦胆子苦素D抑制CAFs促三阴性乳腺癌侵袭与转移的作用。通过本发明为鸦胆子苦素D有效防治三阴性乳腺癌的局部浸润与远端转移以及作为在防治三阴性乳腺癌的药物开发提供实验数据支撑。实验数据支撑。