于志江，陈 旭，欧阳藩
(深圳国家生化工程技术开发中心，深圳518057)
摘 要：冻干技术是基因工程药物制备的常用方法，冻干技术的优点使其正发展成一项产业。介绍了冻干技术的原理、应用、冻干制剂的生产过程，结合工作实际探讨了冻干损伤和保护机理，冻干曲线的确定原则，以及在冻干过程中要注意的重点问题。
关键词：冷冻干燥；冻干曲线；保护剂；基因工程药物
中图分类号:R944,TQ460 6 文献标识码:A 文章编号:1672-3678(2005)02-0058-06
Freeze drying (lyophilization)of genetic engineering pharmaceuticals
YU Zhi jiang,CHEN Xu,OUYANG Fan
(National Engineering Centre for Biochemistry,Shenzhen 5180570,China)
Abstract:Freeze drying (lyophilization)is a common technology extensively used in the genetic engin
eering pharmaceutics field.It is growing up an industry ouring to its excellent characters.Basic principles operation process and application were related in this article.Key points of lyophilization in practice were discussed con cerning the protection measures against the tissue da mage and principles of the freezing curve.Key words:freezing drying;lyophilization;process;protectant;genetic engineering pharmaceutical 随着生物技术的迅猛发展，生物活性物质不断被利用，利用转基因的宿主体(原核和真核)细胞生产的活性物质作为药物已应用于临床，国内外批准上市的已逾50种，正在开发的数量达几百种。其中，大部分是蛋白质和活性多肽。 蛋白质分子的化学结构决定其活性。影响活性的因素很多，主要有两方面，一是结构因素，包括分子量大小，氨基酸组成，氨基酸序列，有无二硫键，二硫键位置，空间结构；二是蛋白质分子周围的环境因素，蛋白质、多肽受复杂的物理、化学因素影响而产生凝聚、沉淀、水解、脱酰氨基等变化。国内已批准上市的基因工程药物和疫苗有20多种，大部分是冻干制剂，原因就是冻干制剂能长期保持蛋白质、多肽的活性。因此，在新药的研发过程中，冻干技术是重要的一个环节。
在加入W TO 后，全球一体化，市场开放，药物二
次加工市场发展迅速，药物外包加工(Outsourcing)早已成为欧美制药工业的一种惯例。据报道,2003年全球药物外包市场达300亿美元,2004年估计达340~350亿美元。制剂外包约占整个药物外包市场的
26%，其余为原料药外包加工。20世纪90年代后，委托加工原料药(订单加工原料药)已被技术要求更高的 提高原料药的加工档次 所代替，即大公司将其开发的新药(原料药)交给具有很强科技实力的科研开发型公司，由后者将新药(尤其是蛋白质/多肽类药以及抗病毒药、抗癌药等等)加工成适合作为纳米级制剂、冻干粉针、口腔快溶片、气雾/干粉吸入剂，以及其他新颖给药途径的原料药。这一方式成为 药物二次加工 的新目标。冻干针剂是其中一项重要的技术产品，如荷兰的DSM 公司，它是欧洲
收稿日期:2005 05 05作者简介：于志江(1965 )，男，江苏南通人，硕士，工程师，研究方向：基因工程药物中试开发。
May 2005 58
生物加工过程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
第3卷第2期2005年5月
著名的药物二次加工大企业，擅长加工抗生素原料药的冻干粉针剂。2004年，投资6200万美元扩大冻干粉针剂生产能力(11台超大型冻干机，每台占地30多m 2
)
，成为欧洲最大的粉针剂生产公司。加拿大的PATHEON 公司是北美主要的药物二次加工企业，主营代加工冻干粉针剂。该公司与意大利合作在意大利建立一个大型的冻干粉针剂生产基地，一台大型冻干装置占地271m 2
。可见冻干技术不但作为基因工程药物生产的一个重要环节，而且其技术的优势可以发展成为一个产业[1]。
烫金膜本文将结合基因工程的多肽和蛋白质药物的冻干针剂生产，结合本中心的中试工作，进行讨论，供同行参考。
1 冷冻干燥技术的原理和应用
[2]
电能计量装置
1 1 原 理
空条件下升华干燥，去除冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为药品准备、预冻、一次干燥(升华干燥)、二次干燥(解吸干燥)、密封保存等步骤。
图1所示纵坐标为气压，横坐标为温度,0 (实际为0 01 )为三相点，表示水以液体存在时的最低大气压，低于该点气压，水只能以冰或蒸气存在，也就是在此时升温时，水只能从冰直接变成蒸气，冷冻干燥就是远低于该气压(高真空度)下干燥水分的，通常在66~133Pa 真空度和-25 以下, 才能保证冷冻干燥顺利进行。
图1 水的三相平衡图Fig 1 Triple point of water
1 2 优点与缺点
冷冻干燥与其他干燥方法相比，有以下优点:
1)药液在冻干前分装，分装方便、准确、可实现连续化;
2)处理条件温和，在低温低压下干燥，有利于热敏物质保持活性，可避免高温高压下的分解变性，以实现蛋白质不会变性;
3)含水量低，冻干产品含水量一般在1%~3%，同时在真空，甚至可在通N 2保护情况下干燥和保存，产品不易被氧化，有利于长途运输和长期保存;
4)产品外观优良，为多孔疏松结构且颜基本不变，复水性好，冻干药品能迅速吸水还原成冻干前状态;
5)冻干设备封闭操作，安装环境洁净度高，减少杂菌和微粒的污染，干燥中和封装后的缺氧可起到灭菌和抑制某些细菌活力的作用。
冷冻干燥及制品的缺点和不足:
1)设备要求高、投资大、干燥速率低、干燥时间长、能耗高;
2)生物活性物质(如多肽和蛋白质药物)采用冻干制剂主要是为了保持活性，但配料(如保护剂、溶剂、缓冲剂等)选择不合理、工艺操作不合理、冻干设备选择不适当都可能在冻干制剂制备过程中失活，导致产品前功尽弃，这是生产冻干制剂的关键，需进行基础研究和针对特定产品反复试验;
3)溶剂不能随意选择，只限于水或一些冰点较高的有机溶剂，所以很难制备某种特殊的晶型，有时冻干品在复水溶解时会出现浑浊现象，这些均为开发冻干制剂所必须考虑和实验研究的。
1 3 冷冻干燥技术的应用
[3]
冷冻干燥技术于1813年英国人Wallaston 发明,1909年Shsckell 试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其他生物制品进行冻干保存，取得了较好的效果。在第二次世界大战中由于对血液制品的大量需求，冷冻干燥技术得到了迅速发展，进入了工业应用阶段。50年代冻干食品系统的大规模发展，促进了冻干技术和设备的进步，但由于高难度、高投入、高能耗和制造设备的落后，经历了几十年的起伏和徘徊。近20多年来，随着人们生活水平提高，对食品的品质、营养、天然无公害的观念转变，推动
了冻干技术的发展，生产过程从间歇式到连续式，设备从0 1m 2到上千m 2形成系列，应用范围广泛：在科研方
2005年5月于志江等：冷冻干燥技术在基因工程药物中的应用 59
面，应用于如分析土壤中的衡量成分；去除高效液相谱收集组分的溶剂；考古中发现的重要文物如布匹、皮革、竹简等的干燥脱水等。在工业上，应用于冻干食品如蔬菜、水果、海产品、甚至鲜花等；香料及调味品如咖啡、茶及各种香料、调味料；保存营养保健成分及香味形的方便食品(日本方便食品中50%是冻干食品)；水产品。最广泛、要求最严格的还是在医药和生物制品方面的应用，主要是应用于血清、菌种、基因工程药物、疫苗、天然药物及生物制品等。我国生物制品规程2000版中，确定的11个重组蛋白药物就有8个是冻干制剂，如重组人干扰素 1b、重组人干扰素 2a、重组人干扰素 2b、重组人干扰素 、重组人白介素 2、重组人红细胞生成素、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组链激酶。
数据的波动1 4 冷干制剂的生产过程
基因工程多肽和蛋白质药物冻干制剂是通过宿主体(微生物或动物细胞)培养获得表达产品、经分离纯化得到活性物质，经过配制、过滤与分装，分装好的样品送入冷冻干燥机，进行预冻、升华、干燥，最后封口。因此冻干制剂的生产过程包括药物准备、预冻、一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)
、密封保存等5个步骤。以下将详细说明。
对于新产品的开发，则必须通过实验来确定冻干的工艺条件，在药物准备好后，要确定药物水溶液的共熔点，共熔点对冷冻干燥很重要，因为药液是一个复杂的液体，当温度下降到某一温度时晶体开始析出，随温度下降，晶体数量增加，到最后才全部凝结，此时温度叫共凝点，若从冷冻状态升温到共凝点，融化开始，这就溶质和溶剂的共熔点。不同物质的共熔点不同，如0 85%氯化钠溶液为-21 2 ，而10%葡萄糖溶液为-27 。共熔点的测量有热分析法、电阻法和低温显微镜直接观察等方法。热分析法是基于冻结的药品在升温过程中，温度达到共熔点时会突然有个能量的吸收，用热分析仪来测定该能量吸收峰可计算得到共熔点温度；电阻法是在降温冷冻或先冷冻后升温过程中电阻突然变大或变小求得，对非离子型有机化合物其电阻变化不明显，可加入一定量的附加剂来测定。冷冻干燥是在真空状态下进行，只有药液全部冻结后才能在真空下升华，否则部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成液体的浓缩，使冻干产品萎缩，而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来，造成液体沸腾，甚至冒出冻干瓶外，所以冻干产品在开始升华时的温度必须低于共熔点，全部冻结。
冷冻干燥时间一般较长，为保证产品质量和缩短生产周期，必需通过反复试验来确定冻干曲线，因为冻干效果是以冻干制剂与原药液的活性保存率来衡量，而活性保存率既与冻干曲线有关，亦与药液的组成与配比有关，因此需多次反复试验才能进行优化与确定。图2是冷冻干燥线示意图。
板层温度; * 产品温度; 真空度
图2 冷冻干燥曲线示意图
Fig 2 Time course of freeze drying
在冻干过程中，把产品和板层(搁板)的温度、冷凝器(冷阱)温度和真空度对应时间作出曲线，简称为冻干曲线，一般以温度为纵坐标，时间为横坐标。在冻干过程中，冷阱温度一般处于制冷机所能达到的最低值，不可调节，因此图2中未加以标明。冻干不同的产品采用不同的冻干曲线，同一产品使用不同冻干曲线时产品的质量也不相同，板层温度和产品温度之差的变化也可能是产品质量变化的原因之一。因为冻干曲线与冻干机的性能有关，不同冻干机应用不同的冻干曲线。
2 药品冻干损伤和保护机理
2 1 药品的冻干损伤
冷冻干燥对细胞或蛋白质产生一定的破坏作用。这种破坏作用主要来自两个方面：机械效应和溶质效应。
冻干过程中会产生多种应力如低温应力、冻结应力、干燥应力破坏细胞或使蛋白质变性。其中冻结应力主要是由于水枝状晶形成，产生相分离，使间隙液体逐渐浓缩，使电解质浓度增加,pH值改变，引起蛋白质的变性和细胞脱水。
2 2 保护剂
为了保护蛋白质、多肽等药物的活性，通常在配
60
生物加工过程第3卷第2期
方中添加活性物质的保护剂。好的保护剂需具备如下特性:
1)玻璃化转变温度高;
2)吸水性差;
3)结晶率低;
4)本身无味，与蛋白质不发生化学反应;
5)价格便宜，易于得到;
6)对于应用于人体的药品，所用保护剂必须对人体无害，是SFDA允许使用的。
常用的保护剂有如下几类物质:
1)糖类/多元醇：蔗糖，海藻糖，甘露醇，乳糖，麦芽糖，葡萄糖等。
2)聚合物:HES,PVP,PEG，葡聚糖，白蛋白等。
3)无水溶剂：乙烯乙二醇，甘油,DMSO,DMF等。
4)表面活性剂:TWEE N80等。
5)氨基酸：丝氨酸，谷氨酸钠，丙氨酸，甘氨酸、肌氨酸等。
6)盐类：磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐等。
在蛋白质药品中，最常用的是甘露醇、乳糖、白蛋白等。海藻糖具有在脱水、干燥、高温、冷冻等情况下保护蛋白质的生物活性免遭破坏的功能，对蛋白质有很好的保护效果，但由于价格高，常用作标准品的保护剂。
2 3 保护机制
保护剂保护药物的机理不同，可分为低温保护和冻干保护。
低温保护被广为接受的原理是优先作用原理，在起稳定作用的保护剂存在条件下，蛋白质优先与水作用(优先水合)，而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外(优先排斥)，此时蛋白质表面有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理也适用于冷冻 溶解过程。但在冻干过程中由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。
对于冻干保护机理，仍在探讨之中。目前主要有两种：水替代假说和玻璃态假说。
1)水替代假说：许多研究者认为，蛋白质分子通过氢键与水连接，当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分的时候，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，在蛋白质表面形成一层假定的水化膜，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构和功能完整。
2)玻璃态假说：在含有保护剂的溶液的低温、干燥过程中，当保护剂的浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂 水就会玻璃化。在玻璃化状态下，物质兼有固体和流体行为，粘度极高，不易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有黏性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的运动受阻，维持蛋白质分子的空间结构，阻止蛋白质的沉淀，起到保护作用。
2 4 保护剂保活实验
冻干保护原理有助于我们选择保护剂。但蛋白质种类很多，性质千差万别，不同的蛋白质需要不同的保护剂配方。究竟哪种保护剂适合要被保护的药物，在通过分析和借鉴经验后，还需要通过一次次试验来确定，这样的试验少则1~2次，多则10多次。
表1是某多肽药物保护剂选择的结果。由于该多肽药物稳定性差，单一的保护剂不能很好地起到保护作用，需要几种一起使用。甘露醇作保护剂的制剂虽然可以将水分控制得很低，但对其稳定性，保护作用没有乳糖强。少量磷酸钾盐的存在能增强保护。该配方制备的多肽药物冻干制剂，纯度在两年内没有明显变化。
表1 保护剂对某多肽药物稳定性的影响
T able1 Effect of protective agen ts on a lyophilized polypeptide in jection
配方
冻干后
水分/%
纯度/%
冻干前冻干后
冻干后,25 ,
24h纯度/%甘露醇0 5898 9798 1071 00甘露醇+甘氨酸0 7898 1697 9978 21
展频原理
乳糖+甘氨酸1 4598 1398 2988 45
乳糖+甘氨酸+磷酸钾1 5698 7898 7197 06
3 药液的配制与分装
药液的配制不仅影响到药物制剂，而且和冻干工艺有关。在低温下，产品的低温热性能的偏差是与配方的变动直接相关[4]。例如，配制之前的工艺水温的升高可能会引起溶液中聚团大小分布的变化，这种变化可能改变产品的过冷性质，而且导致溶液不同批次之间有很大的区别，影响冻干结果。温度对蛋白质、多肽等药物的活性影响也非常大，通常需要尽量保持低温，但低温有时会影响辅料等的溶解度，例如,20%甘露醇在低温下极易结晶析出。除了温度外，辅料和保护剂的浓度、加入顺序，也会对冻干过程和最终产品产生影响。为了保证不同批次
2005年5月于志江等：冷冻干燥技术在基因工程药物中的应用 61
产品的均一性，以上因素需严格控制。
配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体物质含量过少，冻干药品的机械性能就会不稳定，尤其在干燥过程中，药品微粒不能黏附在基质上，溢出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上，甚至会带到冻干室。
以为企业试制的冻干制剂为例：活性成分为酵母菌体，委托方要求水分3%以下，外观良好的前提下，赋形剂、保护剂越少越好。预试验配方如表2。试验表明,5%甘露醇作保护剂可以得到较好的外观和合格的水分。在配制过程中，为方便操作，各成分均配成工作液，如甘露醇、白蛋白、葡萄糖配置成20%溶液，按比例与菌体溶液混合。各溶液温度控制在23 以下。20%甘露醇配制时先加温至60 ，等降温至23 以下再使用，避免剧烈晃动，以防止甘露醇析出。经活性检验，该配方制备的冻干制剂活性保持完好。同时，针剂复溶后的甘露醇浓度5%，为等渗溶液，可减少患者的疼痛感。因此，选定该配方为药剂配方进行中试。
表2 酵母冻干针剂配方试验
T able2 Formulation study on a lyophilized yeast injection
序号保护剂配方外观水分含量/% 1无保护剂*不成形，瓶底一层粉沫 210%甘露醇白结实块状固体0 58 35%甘露醇白疏松块状固体1 50
42 5%甘露醇白疏松块状固体，轻微塌陷，易裂1 64 51%甘露醇塌陷，不成形3 29 62%人白蛋白白(略带淡黄)疏松状固体3 82
71%人白蛋白白(略带淡黄)疏松状固体,
轻微塌陷
8 58
80 5%人白蛋白塌陷，不成形；轻微破碎,
有飞扬现象
19 00
95%葡萄糖白疏松状固体，易碎4 01
102 5%葡萄糖塌陷，不成形3 36
*委托方指定
溶液配制完成，分装前的过滤十分重要。0 2 m滤膜可以除去细菌，也可以滤掉可能存在的纤毛等不溶物。如果冻干的是含有菌体的制剂，可以过滤除菌体以外的溶液，最后加以混合。
4 冻干工艺及优化
4 1 冻 结
冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结过程中的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、最低温度(与共熔点有关)、冻结时间等问题。
配方的影响：配方中固体的含量会影响冻结和干燥过程。如果固体量太少，会影响药品的机械性能，外观可能会塌陷。如果用量太大，除增加成本外，可能会影响到配制过程，如溶解度问题、冻干后的复溶等。疏松但又能保持很好的形状是冻干药品追求的目标。蔗糖、乳糖、甘露醇、白蛋白是最常用的非特定蛋白的保护剂，同时又可充当很好的赋形剂。由于蛋白质种类很多，物理化学性质各异，对于不同的蛋白需要有不同的保护剂配方。有时需多种保护剂共同保护，如表1。
冻结方式的影响：现在一般采用的方式是全域过冷结晶方式，即全部药液处于相同或相近的过冷温度下的冻结方式。在全域过冷结晶中，冻结速率和冰晶成核温度是重要参数。
全域过冷结晶按冻结速率可分为快速冻结和慢速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但存在不完全冻结现象；相反，慢速冻结产生较大的冰晶，而且存在冻结浓缩现象。
大量长期实验的经验表明，在预冻阶段，对于细胞、蛋白质、多肽样品，较快的冻结速率有利于获得成功的冻干样品，对保持样品的活性优于较慢的冻结。
由于冻干机制冷性能的局限，往往不能满足要求的冻干速率。以EPSI LON2 10D中试型冻干机为例，可以设置在30min内从室温降至-40 ，但机器从来没有达到过厂家标明可达到的降温速度指标。因为深圳的室温即使开空调，通常也在23 以上。而机器要求达到指标的 室温 是20 !提前将机器预冷是提高降温速率的好办法。也就是说，在冻干机板层温度降至一个较低的值时，再将药品放入干燥箱内。提前预冻的优点是可以对冻干机的制冷能力要求相对降低，提高冻结速率；缺点是装箱必须迅速，时间不宜过长，否则会导致入箱产品预冻时间长短不一，极易造成产品结晶状况不一致，影响产品的均一性；长时间开启冻干室的门，搁板结霜现象会比较严重。另外，由于箱内温度较低，容易粘连手套等物，对操作人员提出了更高的要求。
最低冻结温度的影响：最低冻结温度和所冻的样品的共熔点有关，按经验值安全的冻结温度是低于共熔点10 左右。
冻结时间的影响：适宜的冻结时间可以确保抽
62
ei矽钢片
生物加工过程第3卷第2期
真空之前所有的产品都已冻实，避免因抽真空而喷瓶。由于物体的传热先表层后内部，冻干箱内的产品不可避免地存在一定的温度梯度，因此就需要相应的保温时间和改善传热效率来缩小温度差异。我们中试型冻干机在样品最低温度达到之后再保持3 ~4h即可冻结均匀。改善热传导效率的一个好办法是将装盘冻干改成抽底冻干，即将冻干瓶直接放置于隔板上。
4 2 干燥阶段
冻结的样品的干燥过程可以分为两个阶段：升华阶段和解吸阶段。
升华阶段：有人认为，在保证样品冻结层温度低于共融点、已干层不变性或结构不崩塌的前提下，温度越高越好。这是一个很难预测的过程。我们的经验是，对于热敏感的蛋白质样品，为了保证样品的活性，缓慢的升温过程可以很好地保证冻干的成功。可以先设置一条比较保守的冻干曲线，虽然可能耗时较多，但能保证得到合格的产品。在此基础上，逐步优化条件，尤其是升华阶段的温度。
升华阶段另一个要注意的问题是，过快的升华速度可能破坏已冻干层的结构。这在冻干含辅料、保护剂少，结构疏松的样品时尤其要注意。样品的表层最先冻干，内部的水分升华时，如果速度过快，会
冲破表面已干层的结构，严重的会飞至瓶外，造成不合格的产品。冷冻干燥的最终目的是为了得到均一的、合格的产品，升华速度的控制必须以此为标准。
解吸阶段：解吸阶段最重要的参数是温度、真空度和时间。温度的选择以不使样品中的成分变性或失去活性为准，越高越好。为了提高传质效率，真空度应在此阶段尽可能低。解吸的时间应与温度综合考虑，对于热敏感的样品，高温时间不宜过长。对于蛋白质、多肽类药品，我们常用的解吸条件是20~ 28 ,0 1Pa,2~4h，可以很好地控制水分。4 3 冻干结束
解吸阶段结束，可以真空压塞或充气压塞。两者水分含量比较见图3。
真空压塞即在冻干解吸阶段结束后，保持真空度，直接压塞，然后破真空，取出瓶子锁盖即可。
充气压塞：一般充入高纯度氮气(99 999%)。冻干结束后，氮气通过除菌过滤器后充入冻干室，当内外压力平衡或冻干室压力稍低于大气压时压塞，此时瓶内充满氮气。取出锁盖即可。
由于胶塞和瓶口的密封性能很难保证不漏气，真空压塞的样品，随着药品的存放，尤其是低温存放，水分往往会上升。充气压塞的优点是药品瓶内外压力基本平衡，更适合长时间的存放。
表3 冻干乙型脑炎活疫苗充氮与真空压塞水分含量比较[5]
T able3 Moisture comparison of lyophilized Japanese B encep halitis vaccine between vacuu m stoppering or nitrogen fillin g
stoppering
代号
充氮压塞
(干后)
充氮压塞
(37 ,7d)
真空压塞
(干后)
真空压塞
(37 ,7d)
11 651 971 802 16
22 302 302 452 59
31 551 822 102 40
41 452 602 252 99
51 893 971 91萎缩
62 10萎缩2 80萎缩
参考文献:
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2005年5月于志江等：冷冻干燥技术在基因工程药物中的应用 63
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