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药敏试验、血凝和血凝抑制试验

药物敏感性试验

[目的要求]

1. 相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，筛选最有疗效的药物，指导临床合理用药，控制细菌性传染病和预防耐药菌株的流行。

2. 熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判定方法；了解药敏试验在实际生产中的重要意义。

[材料与试剂]

1. 实验材料：

1.1 普通营养琼脂培养基：做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基；做沙门氏菌可选择血清培养基。本试验选用普通营养琼脂培养基。

1.2 药敏试纸：购买成品或自制（详见实验准备）本实验选用成品：丁胺卡那霉素、庆大霉

素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、痢特灵、头孢肤肟、奥复星、菌必治、复方新诺明。

1.3 细菌：待做药敏试验的细菌，本试验选用大肠杆菌。

1.4 接种环、酒精灯、恒温培养箱。

2. 实验准备：

2.1 药敏片的准备：购买成品或自制。

2.1.1 药敏片的制备：取1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经103.41Kpa，121℃，15-20min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

2.2.2 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

2.2 药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

2.3 普通琼脂培养基的制备（也可使用成品的营养琼脂）：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml。

[实验内容及操作方法]

1. 在超净工作台中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

2. 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律

的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴6片），每种药敏片的名称要记住。

3. 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

4. 结果观察：在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

5. 判定标准：药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小（mm）参照抗生素等药物敏感度的标准来判定敏感度高低，分为高度敏感、中度敏感、低度敏感和不敏感四种。

[注意事项]

1. 培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲

酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

2. 细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3. 药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐量配制。

4. 培养时间：一般培养温度和时间为37℃ 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4h，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中

的相应抗体和滴定抗体的含量。

[目的要求]

掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。

[材料与试剂]

1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。

2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。

[实验内容及操作方法]

（一）血球凝集(HA)试验

1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。

2. 于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50葵花脱粒机L至第2孔，依次

倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。

3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。

表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：L）

孔号	1	2	3	4	5安全书包	6	7	8	9	10	11	12
病毒稀释度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	1:2048	对照
生理盐水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
病毒液	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
0.5%红细胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
弃50
结果观察	++++	++++	++++	++++	++++	++++		+++	+	+	-	-

4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。

(二) 血球凝集抑制(HI)试验

1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。

2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50L生理盐水。

3. 第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸

弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。

4. 自第1孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。

5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。

表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）

屋顶融雪装置

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
血清稀释度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	病毒对照集束线	血清对照
生理盐水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
被检鸡血清	50	50	50	50	50	50	50隐蔽式水箱	50	50	50		50
4单位病毒	50	50	50	50	50	50	50	50	液压软管接头 50	50	50	50
室温中静置 10 min
0.5%红细胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
弃去50
结果观察	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	++++	++++	-

6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。

从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。

附录

1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液

枸橼酸钠（5H2O） 0.80g

枸橼酸（H2O） 0.055g

葡萄糖 2.05g

氯化钠 0.42g

双蒸水加至 100 ml

将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。

2. 0.5% 鸡红细胞制备方法

先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%鸡红细胞悬液。

3. 96孔微量反应板的清洗

将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。

本文发布于:2024-09-24 17:17:01，感谢您对本站的认可！

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