生物物理学报第十三卷第二期一九九七年六月
ACT A B IO P H YS I CA S I N ICA Vol . 13 No . 2Jun . 1997
杜海彪丘冠英杜严华
( 武汉大学生命科学学院生化与生物物理学系武汉430072)
摘要
用a g a r o s e 电泳和图象处理技术比较了60 Coγ射线、U V 及低能N + 离子处理p U C19 D N A超螺旋结构的损伤效应及若干自由基清除剂的保护效应。结果表明:( 1)γ射线和U V 照射干燥D N A
的损伤显著低于水溶液样品; ( 2) N +离子注入后超螺旋D N A的减少( S C %) 与剂量呈良好线性关 系, 而γ射线和U V 组的SC %随剂量升高呈指数下降; ( 3) 干燥D N Aγ辐照组的D37 值为820 G y ,
SC 完全消失的剂量L D为3814 G y , L D/D37 = 4. 65 ; U V 照射组的相应值分别为: 1. 65J / c m2 ,
7. 65J / c m2 ,4. 64 ; N+离子组的相应值为: 3. 2 ×1015N + / c m2 ,5. 0 ×1015N + / c m2 和1. 56 。虽然上述三
种辐射的剂量单位不同，不能直接比较其相对生物学效应，但从L D 与D37 的比值可反映D N A SC
破坏的程度和终点剂量( S C % = 0) 的大小。从而看出,N + 离子(高L E T辐射) 比γ射线(低L E T辐
射) U V (非电离辐射) 对D N A 损伤作用更强; ( 4) 乙醇、甘露醇等自由基清除剂对电离辐射损伤有 很强的保护作用，但对U V 损伤未见明显的保护效应。
关键词: 离子注入γ射线U V - C p U C19 D N A自由基清除剂凝胶电泳
人们普遍认为D N A是辐射生物学作用的关键靶分子。细胞D N A能被电离辐射的直接和间接作用产生各种损伤(产物可能超过百种) , 包括碱基损伤, 单、双链断裂及D N A交联等1 ,2。近年来，应用双链环状超螺旋DN A如φX174D N A 、SV 40DN A 或质粒DN A结合琼脂糖凝胶电泳技术已成为定量检测D N A链断裂的良好系统3 ,4 。
重离子以其诸多独特性质，以及与太空飞行密切相关，因而日益引起人们的兴趣。但对能量小于1M e v 的低能重离子的生物学作用研究长期未引起重视。近年来，随着离子注入诱发农作物突变的现象被
发现，低能离子生物学研究获得较快发展 5 ，但从D N A 分水平开展的研究尚少。由于低能离子与生物物质的相互作用不但涉及能量沉积, 而且涉及质量沉积(m a s s d e p o si t i o n)及其它物理过程，因而其作用机理比γ射线更为复杂5 ,6 。本文以p U C19D N A为材料, 以DN A超螺旋(SC , Ⅰ型) 转变为开环(O C , Ⅱ型) 和线状(L I , Ⅲ型) 的变化作为产生ssb 、dsb 的定量指标，研究了N + 离子与60 C oγ射线和U V 作用的异同和特点，并比较了几种自由基清除剂的保护效应。
材料与方法
1
1. 1 材料
p U C19
1. 1. 1 D N A 及Eco R Ⅰ购自华美生物工程公司，其它试剂均为分析纯。
1. 1. 2 100n g/μl D N A 溶液的制备: 取100μl D N A 原液(0. 8μg /μl)加入含700μl * 国家自然科学基金资助课题。
T E b uf f e r ( 10m mol
T ri s ·H Cl , 1m mol
ED TA , p H7. 4) 的 E p p e n do rf 管中 , 混匀 , 同法配
制 10n g /μl DN A 溶液置 - 20 ℃备用 。
1. 1. 3 含 0. 1mol / L 乙醇的 10n g / μl DN A 的制备 : 取 20μl 100n g / μl DN A , 加入 20μl 1mo l / L 乙醇和 160μl T E b uf f e r 混匀 ; 同法制备含 0. 1M 甘油 、0. 004M KI 和 0. 04mo l / L 甘露醇的 10n g /μl D N A 溶液 。 1. 2 方法
1. 2. 1 γ 射线照射 : ( 1) 干样品照射 : 剪取 2c m 2
小块铝箔 ，用透明胶带将其固定于平皿中
央 ，加盖 ，灭菌备用 。取 10n g /μl D N A 30μl ，滴于铝箔上 ，室温干燥 ，每组点 6 个皿 ，整个过 程需无菌操作 ; 剂量 : 0 - 1000 G y ，照射后用 30μl T E b uf f e r 洗脱 ，置 E p p e n do r f 管 4 ℃贮存 备用 。( 2) 水溶液样品照射 ：取 10n g /μl DN A 样品 30μl ，置 E pp e n
d o r f 管底部 ，共制备 6 个样 品用于中低剂量 ( 0 - 400 Gy ) 照射 ; 另制备一组 6 个样品用于中高剂量 ( 0 - 1000 Gy ) 照射 , 样 品分别含 0. 1mol / L 乙醇 、0. 1mol / L 甘油 、0. 004mol / L 甘露醇 、0. 04mol / L KI 。
1. 2. 2 U V - C 处理 : ( 1) 干燥 D N A 。样品制备及洗脱方法同前 ,U V 处理用 6W 灯管 ，波 长 254n m , 样品距灯管 20c m , 剂量 : 0 - 0. 88J / c m 2 , 剂量率 : 3. 7 ×10 - 4J / c m 2
/ s 。( 2) 水溶液样品 ：将 30μl 10n g /μl D N A 滴于灭菌铝箔上 ，立即进行 U V 处理 ，处理后的样品吸入 E p p e n 2do r f 管中 ,4 ℃保存 。同法处理含上述保护剂的 D N A 样品 。
1. 2. 3 离子注入 ：样品制备同γ 照射干样品 。N +
离子注入在中国科学院等离子体物理研
究所进行 。方法参见前文7
，离子能量为 30k e v ，剂量范围 : 0 —1. 5 ×1016
N +
/ c m 2
，脉冲式注入 ,
每次脉冲剂量为 0. 1 ×1015 N + / c m 2
。对照样品同样放入靶室但不接受离子注入 。样品洗脱方法同前 。
A g a r o s e 凝 胶 电 泳 : 将 上 述 处 理 后 的 DN A 样 品 进 行 电 泳 。用 1 ×T
B E ( 0. 09 1. 2. 4 T r i s - 硼酸 , 0. 002m o l / ED T A ) 缓冲液 , 1. 4 % a g a ro s e g el , 加入 0. 5 % EB
mo l / L L 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0 0
200 400 600 800 1000
Do se ( G y )
Fi g . 1
P h o t o of EB st a i n e d a g a r o s e g el of
Fi g . 2 dr y Do s e - eff e ct c u r v e of p U C19
e x p o s e d γ - r a y .
p U C19 D N A i n T E buff e r co
n t a i n i n g 0. 1mol / D N A to to γ - L et ha n ol e x p o s e d r a y . Fro m lef t to
ri g h t :λ/ Hi n d Ⅲ ma r k e r , D N A t reat e d b y 0 ,200 ,400 ,600 , 800 , 1000 G y a n d L I D N A ma r k e r .
Fro m top to bo t t o m O C , L I a n d SC ba n d of p l a s mi d D N A we r e o b se r v e d .
第 2 期 263
三种类型辐射对质粒超螺旋 D N A 损伤的研究
( Et hi di u m B ro mi d e ) , 电压 2. 5V / c m , 每 孔 加 样 量 约
0. 3μg , 电泳后的凝胶于紫外
灯下照相 。
2. 0
云朵制造机
80
1. 2. 5 数 据 处 理 :
将
1. 0
40
电泳照片用图像扫描仪扫描 , 输入计算机 , 再将电泳带的大 小和强度转化为灰度值 , 将图 像数字化 。由于超螺旋 D N A
泥沙过滤器与 E B 结 合 比 开 环 和 线 状
D N A 少 , 我们参照文献
8 ,9
的
方 法 将 其 灰 度 值 乘 以 1. 4 进
0. 44 Do se (J / c m 2
)
0. 88
0 1 3 5 Do se ( ×101 5
N +
/ c m 2
)
Fi g . 3 Do s e - eff e ct c u r v e of Fi g . 4 p U C19 Do s e - eff e ct c u r v e of
p U C19 dr y
U V - C.
D N A e x p o s e d to
D N A i r r a d iat e d bea m .
b y +
N
io n 行校正 , 从而得到各种不同构型 D N A 的相对含量 , 图像扫描及数据处理在本室和华中理工大 学电信系进行 。
结 果
2 2. 1 三种类型辐射处理干燥 D NA 样品的结果
质粒超螺旋 DN A ( SC , Ⅰ型) 由完整双链 D N A 组成 , 开环 D N A ( O C , Ⅱ型) 由 D N A 单链断裂 ( ssbs ) 产生 ；线性 DN A (L I , Ⅲ型) 由 D N A 双链断裂 ( dsbs ) 产生 。照射后超螺旋结构的减少反映 ssb 和 dsb 产生的共同结果 , 在一般实验条件下 , 主要是 ssb 引起 SC 型转变为 O C 型所致 (L I
型所占比例较小) 10 。图 1 是所得电泳照片的一例 , 图 2 和图 3 分别表示干样品经γ射线和 U V 处理后 SC %随剂量升高呈指数下降 , 在半对数坐标上为一直线 ; 而 N + 离子注入后 SC %与剂量呈良好线性关系 (图 4) 。通过上述曲线可求得 D N A 干样品经γ 射线 、U V 和N + 离子注入 D 37 (即 SC %降至 37 %时的剂量) 值分别为 820 G y 、1. 65J / c m 2 和 3. 2 ×1015 N + /
In h i b i t i o n of γ r a y s i n d uce d p U C19 D N A c h e m ical s . T a b l e 1 da m a g e b y
c m 2
。
2. 2 γ 射 线 和 UV 处 理
溶液状态 D NA 的结果
γ 辐照 T E 缓冲液中
D N A 及含自由基清除剂
的 DN A 溶液的结果见图
5 。图
6 是 同 样 条 件 下 U V 处理的结果 。根据下
D 37 ( G y ) Gssb (μmol / J ) En vi r o m e n t D R F 8. 8 ×10
- 5
7. 54 ×10 - 6
8. 42 ×10 - 6 T E buff e r
T E + 0. 1mol / L et ha n ol T E + 0. 1mol / L g l y ce r ol T E + 0. 04mol / L ma n n i t ol 65 760 680 500 1 11. 7 10. 5 7. 7 1. 15 ×10
- 5 - 5
T E + 0. 04m m ol / L KI
278
2. 06 ×10
4. 3
式 9 可求得诱发 ssb 的 G 值 (每吸收 100e V 电离辐射能量所产生的单链断裂数) :
G ssb = C DN A / (D 37 *ρ
) 式中 C DN A 为 D N A 的浓度 (μmo l / d m 3
) ρ
, 为溶液密度 ，此处定为 1k g / d m 3 。表 1 列出γ 辐照组 的 D 37 、G ssb 及相应的 D R F (Do se re d uct i o n f a cto r ) 值 。
从图 3 、图 5 、图 6 及表 1 可见 : ( 1) . 水溶液样品的γ 射线和 U V 辐射损伤显著大于干样 品 ,γ 辐射的 D 37 比值为 12. 6 ( 820/ 65) , U V 的比值为 3. 78 ( 1. 65/ 0. 436) (据图 3 曲线外推值
2. 0
80
1 2
3
1. 0
40
3 4
4
2
5
1
0 400 800
Do se ( G y )
0. 44 Do se (J / c m 2 )
0. 88
Fi g . 5 Do s e - eff e ct c u r v e s of p U C19 Fi g . 6 p U C19 Do s e - D N A i n eff e ct
sol ut i o n c u r v e s
of
D N A i n sol u t i o n i r r a d iat e d b y γ r a y . 系列 t reat e d b y 1. i n T
E buff e r + 0. 1mol / L Et ha n ol . 系
U V - C. 系列 1. 2. i n T E buff e r 系 列 3. i n T E Ma n n i t ol . 系 列
i n T E buff e r . 系列
+ 0. 1mol / L et ha n ol . buff e r + 0. 04mol / L 4. i n T E buff e r + 列 2. i n T E buff e r + 0. 1mol / L G l y ce r ol . 系列 3. 系列 4. i n i n T E buff e r T E buff e r + 0. 04mol / L KI . + 0. 04mol / L Ma n 2
ni t ol . 系列 5. i n T E buff e r .
0. 1mol / L G l y ce r ol .
运行网和图 6 曲线 1) , 显示在水溶液状态下间接作用比直接作用对诱发 ssb 更重要 , ( 2) 几种保护剂 对 DN A 链断裂具有明显的保护效应 ，其 D R F 值达 4. 3 - 11. 7 (表 1) 。
讨
论
3 3. 1 低能氮离子 、
γ 射线和 UV 损伤效应的比较 如前所述 , 干 D N A 样品的 SC %随 U V 和γ 射线剂量的升高呈指数规律下降 (见图 2 和
图 3) ，而低能离子处理组的 SC %随剂量增加呈线性下降 (图 4) 。U V 、N +
离子注入和γ 射线处 理干样品的 D 37 值 、L D (使 SC 完全丧失的剂量) 和 L D / D 37 值见表 2 。虽然三种类型辐射的剂 量单位不同 , 不能直接比较其相对生物学效应 ( RB E) , 但从 L D / D 37 值可以反映 D N A SC 破 坏的程度和终点剂量 ( S C % = 0) 的大小 。从而看出 , 离子注入 (高 L E T 辐射) 比γ 射线 ( 低 L E T 辐射) 和 U V (非电离辐射) 对 D N A 超螺旋的损伤更强烈 。可以认为 ，这
与射程极小的低 能离子束具有的局部高电离密度有关 。过去一些学者认为 , U V 直接引起 D N A 链断裂 , 尤其 dsb 的发生率很低 ，以至微不足道 。这一看法近年已经改变 ：用离体 D N A 及活细胞的试验证明 U V - C 均有较强的单 、双链断裂效应11 ,12 ，本试验结果也支持这一结论 。 3. 2 UV 和γ 射线对溶液状态 D NA 的损伤效应
对于水溶液样品 γ, 射
线 处 理 后 SC % 随 剂 量 的
升高成指数规律下降 , 而 U V 处 理 后 的 SC % 与 剂 量成线性关系 。相对于干 样品 , 溶液样品对γ 射线 和 U V 的 敏 感 性 显 著 上
T a b l e 2
V a l ue of D 37 , L D a n d L D / D 37 . T reat me n t
D 37 L D L D / D 37 1. 65J / c m 2
820 G y 3. 2 ×1015
N +
/ c m
2
7. 65J / c m 2
3814 G y 5. 0 ×1015
N +
/ c m 2
U V
γ r a y
io n i m p la n t a t i o n逐步追踪
4. 64
4 . 6
5 1. 56
第 2 期 265
三种类型辐射对质粒超螺旋 D N A 损伤的研究
光端机机箱升 。以 D 37 值为参量 γ, 射线处理的水溶液样品下降 12. 6 倍 ,U V 处理的水溶液样品下降 3. 78 倍 。可见γ 射线的间接效应比 U V 更强 。业已证明 ，水溶液 DN A 样品的γ 射线间接效应主要
由 O H ·自由基攻击 DN A 分子所致 13 , 14
, U V 间接效应的机理曾被认为也是水辐解产生
O H · ,e - a , H ·等自由基的作用 ，但进一步研究发现这种解释只适用于波长小于 170n m 的 U V q
区12 ，而对 U V - C ( 254n m ) 可能存在另一种机理 ，其详细作用机理有待进一步揭示 。
在 D N A 水溶液样品中加入一定浓度的乙醇 、甘油 、甘露醇和 KI 后 ，对辐射损伤均有不同
程度的保护作用 ，其中 , 0. 1mo l / L 乙醇的保护作用最强 ，其 D 37 值 ( 760 G y ) 为对照样品的 11.
7 倍 (见表 1) ，接近于干样品的 D 37 值 。含 0. 04mo l / L 甘露醇和 0. 04m o l / L KI 样品的 D 37 值分 别为对照的 4. 3 倍和 7. 7 倍 , 说明甘露醇和 KI 对γ 射线损伤也有较强的保护作用 。一般认 为 ，这些保护剂的保护效应主要在于清除水辐解自由基 ，特别是清除 O H · 作用9 ,16 ,17 。 多次重
复实验表明 , 上述自由基清除剂对水溶液 D N A 样品 U V 损伤的保护作用比γ 辐
照组弱得多 。这与 Ewi n g 等 15 报道 alco hol s 类 O H ·
清除剂对 U V - C 所致 E . coli DN A 损 伤没有明显的保护作用相一致 。他们认为 U V - C 一般不能引起水辐解 ,alco ho l s 的轻度保护 作用可能是通过修饰 DN A 直接损伤而并非清除 O H ·自由基的作用 。 由于目前低能离子注入
必须在真空靶室中进行 , 因此不能进行溶液样品及有关防护剂保 护效应的比较研究 。尽快研制较高能量的离子束进行靶室外注入的设备对开展此类研究是很 有必要的 。
参考文献
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