1787
【实验研究】
*
*基金项目：海南省卫健委“省级中医治未病中心能力建设”项目
（琼卫中医函〔2019〕9号）；国家中医药管理局“全国名老中医药专
家传承工作室”建设项目］琼财社（2014）2161号］
作者简介：林道斌（1993-），男，海南文昌人，硕士研究生，从 事消化内科的中西医结合临床与研究。
△通讯作者：程亚伟（1982-），女，河南许昌人，副主任医师， 硕士研究生，从事脾胃肝病的中医药临床与研究，Tel ： ，E-mail ：yaweicheng@ 126. com 。
林道斌，杨华，程亚伟△
(海南省中医院脾胃肝病科海口 570000)
摘要：目的：运用网络药理学研究方法对山楂非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease ，NAFLD )主要活性成
分及核心靶点进行分析o 方法：采用中药系统药理学分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform TCMSP )筛选出山楂的有效活性成分及作用靶点蛋白，再使用Unipro 数据库将筛选出的靶点蛋白转换为基因名，
通过Gene Cards 数据库、人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man ，OMIM )和靶点、数据库(therapeutic target database ，TTD )收集NAFLD 疾病基因，然后对药物作用基因及疾病相关基因进行vnne 分析，寻交集靶点，用交集靶点与对 应活性成分构建活性成分-靶点相互作用网络，并进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析°结果：研究得到6个作用于
NAFLD 疾病靶点的活性成分和148个作用靶点，GO 功能富集分析确定了 350个条目，KEGG 通路分析共发现97条作用通路。结
论：本研究结果初步探讨山楂的基本药理作用及其机制，并为进一步的试验研究奠定良好基础。
关键词：网络药理学；山楂；非酒精性脂肪肝病；作用机制
中图分类号：R575. 5 文献标识码：B 文章编号：1006-3250(2020) 12-1787-08
Analysis of Components and Potential Targets of Hawthorn in The Treatment of
Nonalcoholic Fatty Liver Disease on The Basis of Network Pharmacology
LIN Dao-bin, YANG Hua,CHENG Ya-wei ^
(Depar£rnen£ of sp/een , s£ornacA and //fer d/seases, 弘/nan Aosp/£aZ #£rad/£/onaZ CA/nese rned/c/ne ，弘认ou 570000,CA/na)
Abstract : Objective : To analyze the main ingredients and core targets of Hawthorn in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease ( NAFLD) using the method of network pharmacology. Methods : Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform TCMSP were used to screen the active ingredients and target proteins of Hawthorn. Unipro database was used to convert the selected target proteins into gene names. Gene Cards database and online Mendel genetic database were used to screen the active components and target proteins of Hawthorn. Elan inheritance in man ( OMIM) and the
rapeutic target database ( TTD) were used to collect NAFLD disease genes. Then the drug-acting genes and disease-related genes were analyzed by vnne to find the intersecting targets. The active component-target
interaction network was constructed with the intersecting targets and the corresponding active components. GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed. Results : Six active components and 148 target sites were identified ， 350 items were identified by GO functional enrichment analysis ， and 97 pathways were identified by KEGG pathway analysis. Conclusion : The results of this study preliminarily discussed the basic pharmacological action and mechanism of Hawthorn ， and laid a good foundation for further experimental research.
Key words : Network pharmacology ； Hawthorn ； Non-alcoholic fatty liver disease ； Mechanism of action
指纹挂锁非酒精性脂肪性肝病（NAFLD ）是指排除酒精性 因素及其他明确肝损害因素外，以甘油三酯为主的脂 肪类物质在肝细胞中异常堆积为主要病理特征的一 种肝脏代谢疾病［1］。大量脂肪类物质在肝脏的蓄积 极易诱发肝细胞脂肪变性及炎症反应，致使肝纤维化 形成，最终将导致肝脏恶性病变的发生［2］o 流行病学
调查表明，NAFLD 在我国的发病率约为15%［3］，积极
发掘NAFLD 的药物已刻不容缓。
山楂为常见的药食两用类药物，有文献表明对 NAFLD 有着良好效果⑷。山楂提取物山楂总 黄酮能从抗氧化应激［5］、促进肝脏脂质代谢同、抗
血小板聚集［7］等多个方面对NAFLD 产生作 用。目前关于山楂的中药药理学研究多从单个成分 展开，与中草药多成分、多靶点发挥功效的实质相 悖。因此课题组运用网络药理学［8］方法，研究山楂
NAFLD 的作用机制，并为进一步试验室研究提 供先导信息。
1 材料与方法
1. 1山楂主要活性成分及作用靶点筛选
中药系统药理学分析平台（TCMSP ） （ http ：//
1788
lsp.nwu.edu/t cmsp.php)是由西北农林科技大学依托文献挖掘和数据库整合建立的中药系统药理
diat学数据库和分析平台。该数据库收录了500味常用中药以及30069个中药化合物的药物化学和药物-靶标蛋白网络-疾病网络、药物代谢动力学的基本信息［9］，是目前研究网络药理学最常用的的数据库。通过该数据库检索山楂的所有活性成分，再根据口服利用度(OB)M30%和类药性(DL)M0.18进一步筛选药物的主要活性成分,OB和DL是评判药物有效利用度的关键指标。一般而言，OBM30、DLM 0.18的活性成分可视为药物的主要活性成分［⑹。再通过TCMSP检索各个活性成分的作用靶点蛋白，然后利用Uniprot数据库［11］将获取的蛋白名称转换为基因名。
1.2疾病靶点的获取与交集靶点的筛选
运用gene cads数据库(https：//www. /)［12］、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)(/)［13］和靶点数据库(TTD)(bidd.nus.edu.sg/group/ cjttd/)［⑷寻NAFLD的疾病靶点建立数据集，并与1.1筛选出的药物靶点进行vnne分析，获取交集靶点。
1.3活性成分-靶点网络的建立
运用Cytoscape3.6.1软件［⑸建立活性成分-靶点的相互作用网络关系图，再通过Network Analysis 插件分析各个节点的度值(Dgree)，根据网络节点的Dgree大小做进一步分析。
1.4京都基因与基因组百科全书通路注释分析
最后再将1.2获取的交集靶点导入DAVID在线平台(https：//v/)［16］行GO、KEGG功能注释和富集分析。在DAVID平台，基因标识符合选择OFFICIFAL-GENE-SYMBOL，基因背景栏勾选HomoSapiens，然后选择“Functional Annotation Tool”作为分析工具，所有检取结果根据FDR(错误发现率)<0.01进行筛选。
2结果
车载卫生间
2.1活性成分及药物靶点筛选结果
在TCMSP数据库并无山楂常用药用部位果肉的条目，但有山楂叶相关条目。后通过检索文献［⑺山楂叶活性成分与果肉相似，并常作为代用品使用。故以TCMSP数据库中山楂叶活性成分作为研究对象，并根据OBM30%和DLM0.18作为条件共检索到6种主要活性成分，分别是槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、异鼠李素(isorhamnetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、表儿茶素(ent-Epicatechin)、谷笛醇(sitosterol)等。药物靶点共检索到279个，去重保留唯一值后有194个,6种活性成分均有各自的作用靶点。
2.2交集靶点筛选结果与活性成分-靶点网络的建立
以NAFLD的英文全称non alcohol fatty liver disease为关键词，在genecads数据库共到3538个相关靶点基因,OMIM数据库到202个,TTD数据未发现相关靶点。上述靶点去重保留唯一值后共获得NAFLD靶点基因3645个，与2.1经Uniprot数据库校正过基因名的靶点进行vnne分析后，确定了148个山楂NAFLD发挥作用靶点(见图1)。而后将这148个靶点与其对应的活性成分导入Cytoscape3.6.1软件后，建立一个各个节点联系密切的相互作用网络关系图(见图2)。在该图中共有154个节点，绿三角形的活性成分节点有6个，红圆形的靶点节点有148个。本研究还运用Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network插件对该网络图中的每个节点进行分析，得到网络中各个节点的度值(Degree)，槲皮素、山柰酚、异鼠李素、豆甾醇等4个活性成分节点Degree明显高于表儿茶素和谷甾醇(见表1)，这也意味着这4种活性成分在山楂NAFLD过程中占有重要地位。靶点方面，Degree均值约等于1，有48个靶点节点Degree高于均值(见表2)，这些靶点可能是山楂NAFLD的关键调控靶点，Degree均值最高的10个靶点分别是前列腺素G/H合酶1( PTGS1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、雄激素受体(AR)、一氧化氮合酶(NOS3)、二肽基肽IV(DPP4)、丝氨酸蛋白酶1 (PRSS1)、凝血因子VII(F7)、单胺氧化酶B (MAOB)、转录因子P65(RELA)。
分子编号中文名称英文名称OB(%)DL度值(Dgree) MOL000354槲皮素quercetin49.600.31118 MOL000359山柰酚kaempferol36.910.7545 MOL000422异鼠李素isorhamnetin41.880.2426 MOL000
449豆甾醇Stigmasterol43.830.7623 MOL000073表儿茶素ent-Epicatechin48.960.243 MOL000098谷甾醇sitosterol46.430.28
2
1789
图2活性成分-靶点相互作用网络关系图
（节点大小与Degree 成正比）
2. 3 GO 功能注释及KEGG 通路富集分析结果利用DAVID 平台的GO 和PATHWAY 富集分 析功能对148个靶点进行研究,GO 富集分析中根据 FDR<0. 01确定350条GO 条目，涉及生物过程的有 260条，如对药物反应、转录正调节、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调节等。涉及分子功能的有60条， 如酶结合、蛋白质结合、RNA 聚合酶II 转录因子活 性等。涉及细胞组成的有30条，如细胞外空间、细 胞质、膜筏等。同时根据FDR<0. 01共到97条作
用通路，如癌症通路、TNF 信号通路、HIF-1信号通
路等（表3表4分别列举了 FDR 最小的前20条GO 和KEGG 通路分析结果）。
3 讨论
本研究共发现6种主要活性成分及148个作用 靶点，其中Degree 值最高的4种主要成分里，槲皮 素能通过抑制炎症因子表达［18］、抗氧化应激反 应［19］、改善胰岛素抵抗［20］及脂代谢紊乱［21］等诸多
途径对NAFLD 产生作用。另一化合物山柰酚 也有类似抗炎［22］和抗氧化［23］作用，异鼠李素可以 抑制胶原蛋白的形成［24］、抗肝纤维化，并且可以抑 制PPAR 7的表达，防治肝脂肪变性［⑸。豆甾醇可 以提高过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的表 达［26］以及降低过氧根离子的生成速率，清除肝内氧 自由基，降低肝脂肪过氧化［27］
靶点方面，前10个靶点分别为PTGS1、PTGS2、 PPARG 、AR 、NOS3、DPP4、PRSS1、F7、MAOB 、RELA 等。其中前列腺素G/H 合酶1 （ PTGS1）和前列腺 素G/H 合酶2（ PTGS2）又称环氧化酶（COX1/2）】28］ 是将花生四烯酸转化为前列腺素的关键性限速 酶［29］ ,COX1为结构型同工酶，COX2为诱导型同工 酶［30］。COX1广泛分布于人体的组织脏器如胃、肾、 血管等，对调节胃、肾的血流量、血管舒张、胃黏液分 泌起重要作用，维持着机体的正常生理过程［31］。但 COX1在NAFLD 的疾病过程中扮演的角目前鲜 有报道，研究主要集中在另一种亚型COX2上。
表2在活性成分-靶点网络中高于靶点均值的基因比较
基因名称
度值（Degree ）
基因名称
度值 ( Degree )
PTGS1（前列腺素G/H 合酶1）
5TNF （肿瘤坏死因子）2PPARG （过氧化物酶体增殖物激活受体y ）5JUN （ AP-1转录因子亚基）
2PTGS2（前列腺素G/H 合酶2）
5AHSA1（ATP 酶活性的激活剂1）
2AR （雄激素受体）4CASP3（半胱天冬酶家族成员3）2NOS3（ 一氧化氮合酶-3）
4MMP1（基质金属蛋白酶1）
2DPP4（二肽基肽IV ）
3STAT1（信号传感器和转录激活因子1）
2PRSS1（丝氨酸蛋白酶1）3HMOX1（血红素加氧酶1）
2F7（凝血因子VII ）3CYP3A4（细胞素P450家族3亚家族成员4）2RELA （转录因子P65）3CYP1A2（细胞素P450家族1亚家族成员2）2MAOB （单胺氧化酶B ）
3CYP1A1（细胞素P450家族1亚家族成员1）2ACHE （乙酰胆碱脂酶）3VCAM1（血管细胞粘附分子1）
2XDH （黄嘌吟脱氢酶）
3NR1I2（核受体亚家族1第一组成员2）
2PGR （孕激素受体）
3CYP1B1（细胞素P450家族1亚家族B 成员1）
2TOP2A （ DNA 拓扑异构酶II ）3
GSTP1（谷胱甘肽S-转移酶Pi 1）2NOS2（ 一氧化氮合酶2）
2AHR （芳基烃受体）
2ESR1（雄激素受体1）2SLC2A4（葡萄糖转运蛋白2）
2PIK3CG （磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基y ）
2NR1I3（核受体亚家族1第一组成员3）
2AKR1B1( Aldo-Keto 还原酶家族1成员B )2INSR （胰岛素受体）
多视点2NR3C2（核受体亚家族3 C 组成员2）
2GSTM1（谷胱甘肽S-转移酶Mu 1）2CHRM1（胆碱能受体毒蕈碱1）2GSTM2（谷胱甘肽S-转移酶Mu 2）
2CHRM2（胆碱能受体毒蕈碱2）
2RXRA （维甲酸X 受体a ）
2IKBKB （核因子Kappa B 激酶亚基0抑制酶）2ADRB2（肾上腺素受体02）
2BCL2（B 淋巴细胞瘤-2）
2PLAU （尿激酶）
2BAX （促凋亡因子Bax ）
2
SCN5A （钠电压门控通道Alpha 子单元5）
2
1790
表3潜在靶点的GO分析结果比较（FDR<0.01）
人脸识别门类别编号名称基因数FDR
分子功能0019899enzyme binding30 3.97x10_18生物过程0042493response to drug26 1.55X10-14生物过程0045893positive regulation of transcription,DNA-templated309.66x10_13细胞组成0005615extracellular space44 1.01X10-12生物过程0045944positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter39 2.71X10-12生物过程0007568aging19 6.20x10_12生物过程0043066negative regulation of apoptotic process27 2.38x10_11生物过程0071456cellular response to hypoxia15 1.40X10-10生物过程0010628positive regulation of gene expression21 1.67X10-10生物过程0001666response to hypoxia18 1.98X10-10生物过程0008284positive regulation of cell proliferation26 3.38X10-10生物过程0071222cellular response to lipopolysaccharide15 1.42X10-09分子功能0005515protein binding117 1.23X10-09生物过程0045471response to ethanol149.72X10-09
分子功能0004879RNA polymeraseII transcription factor activity,ligand-activated sequence-specific
DNA binding
10 2.07X10-08
生物过程0032355response to estradiol13 3.07X10-08分子功能0042803protein homodimerization activity29 2.55X10-08分子功能0003707steroid hormone receptor activity11 5.45X10-08生物过程0006954inflammatory response21 1.47X10-07分子功能0046982protein heterodimerization activity22 6.26X10-07
表4潜在靶点的KEGG分析结果比较（FDR<0.01）
编号名称基因个数FDR
hsa05200P athways in cancer40 1.60X10-15 hsa05161Hepatitis B26 1.32X10-14 hsa05212Pancreatic cancer17 4.39x10_11
hsa04668TNF signaling pathway209.28X10-11
hsa04066HIF-1signaling pathway18 2.21X10-09 hsa05210Colorectal cancer15 6.92x10_09 hsa05142Chagas disease(American trypanosomiasis)179.66x10_08 hsa05205P roteoglycans in can
cer22 1.53X10-07 hsa05219Bladder cancer12 1.92X10-07 hsa05145Toxoplasmosis17 2.31X10-07 hsa05222Small cell lung cancer15 6.25x10_07 hsa05215Prostate cancer15 1.01X10-06 hsa05213Endometrial cancer12 3.08x10_06 hsa05223Non-small cell lung cancer127.12x10_06 hsa05140Leishmaniasis138.53x10_06 hsa05166HTLV-I infection22 1.25X10-05 hsa04151PI3K-Akt signaling pathway25 2.98x10_05 hsa05014Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)11 3.02x10_05 hsa05164Influenza A18 3.14x10_05 hsa04917Prolactin signaling pathway129.61X10-05
COX2在正常细胞中的表达水平很低，但在刺激因子如炎症介质、内毒素等作用下会急剧上调，通过调高前列腺素的合成参与机体的炎症反应［32］o有报道称［33］,COX2的表达水平与肝功能损伤程度成比。在NAFLD早期由于肝细胞脂肪变性可诱导COX2的高表达［34］，而COX2及其介导产生的白介素-6、肿瘤坏死因子-a、前列腺素等又会干扰正常的肝细胞脂质代谢过程［35］，从而形成恶性循环。结合目前研究，山楂可能通过作用于环氧化酶靶点控制炎症反应，恢复肝脏正常脂质代谢。
过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）是一类由配体激活的转录因子，目前已发现有3种亚型PPARa、PPAR0、PPARy等［36］。其中由PPARG编码的PPAR y如果过度表达，可抑制环磷酸腺昔反应
1791
机械臂
Count
PValue
潜在靶点的GO分析结果条形图(FDRvO.01)
图3
元件与蛋白的结合，诱导肝脂肪细胞变性⑶-进而演变为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。但值得注意的是，如果敲除小鼠PPAR y基因反而会促进NASH的形成［38］。更有研究显示［39］,PPAR7可以调高脂联素的表达，控制炎症因子的分泌，延缓肝纤维化进程。并且PPAR y还可以增加肉毒碱脂酰转移酶以及乙酰辅酶A的表达减少肝脂肪沉积［40］。总的来说，PPAR y既可以加速NAFLD疾病演变，又可以缓解脂肪变性及肝纤维化，其机理暂不明晰，可能与PPAR y的其他亚型有关。
雄激素受体(AR)属于核受体超家族成员，分布于体内多个组织脏器。由其介导的雄激素在糖脂代谢过程中发挥着重要作用。AR可以提高雄激素的释放，从而加强对肝内硬脂酰辅酶A去饱和酶1、脂蛋白酯酶、脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶等多个脂代谢关键酶的调控，维持脂肪合成与分解的稳态⑷打另外，雄激素可以降低肿瘤坏死因子a、白介素6、白介素1P的表达水平［42］，减轻炎症因子对肝细胞的损害。山楂作用于AR靶点，可从调控脂代谢及炎症反应途径产生作用。
NOS3又称内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，是人体内合成一氧化氮(NO)的关键性合成酶之一［43］，尤其合成的NO在肝脏损伤时脂质过氧化和氧化应激反应中占有重要地位，过量合成的NO会破坏NO 与O2-的平衡，生成过氧化亚硝酸阴离子，继而造成不饱和脂肪酸、胆固醇、超氧化物歧化酶的氧化［44］，加剧氧化应激程度，造成严重后果。故而山楂作用于eNOS靶点，可减轻NAFLD时的氧化应激反应。
二肽基肽IV(DPP4)既往研究多集中于2型糖尿病的作用。但近年来研究发现［⑸，DPP4还参与多种慢性肝病的发生发展，其中就包括NAFLD。DPP4参与NAFLD的机制与其促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)降解有关［46］,GLP-1可以提高机体对胰岛素的敏感性，减少肝脏脂肪沉积以及调节肝脏脂肪酸代谢［47］。而DPP4的高表达会导致GLP-1的大量失活，导致上述生物过程的失控，所以抑制DPP-4可以改善肝细胞脂肪变性，山楂作用于该靶点，可能也扮演着DPP-4抑制剂的角。
PRSS1
在受到炎症因子的刺激时会继发磷酸
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议