DNA测序试剂盒中文操作手册 BigDye Terminator v3.1和v1.1 BigDye Terminator试剂盒简称BDT。BDT v3.1是DNA测序的标准试剂盒，而BDT v1.1则是专门为PCR 产物测序而优化设计的。BDT v3.1适用于所有类型DNA模板的测序，对于长片段测序更具优势。 dGTP-BigDye Terminator试剂盒简称BDG。BDT是DNA测序的标准试剂盒，而BDG则是专门为困难模板测序而优化设计的。长的重复序列、二级结构、富含GC的片段等通常会干扰测序PCR反应，导致测序失败的DNA模板称为困难模板。只有BDT v1.0、v2.0和v3.0有相应的BDG试剂盒，BDT v1.1和v3.1本身已有足够能力对付困难模板，所以没有相应的BDG试剂盒。 BDT v1.0、v1.1、v2.0以及BDG v1.0、v2.0可以使用同样的matrix或者光谱校正；BDT v3.0、v3.1以及BDG v3.0可以使用同样的matrix或者光谱校正。Matrix与光谱校正是同义词。在不同型号的仪器上，测序的Dye Set选择如下：
BDT v3.1 BDT v1.1
310/377 E E
3100/3100-Avant Z E
3700 v2.0 H E
3700 v1.1和v1.1.1 D E
注意：少数早期的3100和3100-Avant软件中没有MtxStd{Sequencing-SetZ}.par文件，这时可以用MtxStd{Sequencing-SetE}.par代替，用于做BDT3.1的光谱校正。
以下操作适用于BDT v1.1和BDT v3.1试剂盒，而且对于这两种试剂盒的操作完全一样，但是不适用于BDT v1.0、v2.0和v3.0以及 BDG v1.0、v2.0和v3.0试剂盒。
1. 测序DNA模板的纯度与用量
DNA纯度：OD260 / OD280 = 1.6 ~ 2.0。DNA用量：
PCR产物
ng
1-3
bp
100-200
3-10
ng
bp
200-500
5-20
ng
bp
500-1000
10-40
ng
bp
1000-2000
ng
bp 20-50
2000
>
压片机模具
单链DNA 25-50 ng
ng
质粒，双链DNA
150-300
BAC 0.5-1
μg
Cosmid,
μg
细菌基因组DNA
2-3
推荐使用酒精/NaAc法或者Centricon-100纯化柱(PN: N930-2119)在测序前对PCR产物进行纯化，然后再进行DNA测序的PCR反应。如果使用纯化柱，按生产厂家建议的步骤进行操作，但是将离心速度由1000 x g 提高到3000 x g。 所有试剂从冰箱中取出融化后，请先稍微振荡，混匀离心，然后使用。操作在冰上进行。
2. 质粒和PCR产物测序
试 剂 用 量
DNA 1 μL
BigDye 8 μL
μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
灭菌去离子水10 μL
总体积20 μL
测序PCR热循环条件：
96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环→ 4 °C保温
1/2反应体系（20 μL，96孔板）：
试 剂 用 量
DNA 1 μL
x)
μL
4
(2.5
BigDye
BigDye Seq Buffer (5 x) 2 μL
μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
灭菌去离子水12 μL
黄曲霉毒素测定
总体积20 μL
测序PCR热循环条件：
96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环→ 4 °C保温
1/2反应体系（10 μL ，384孔板）：
试 剂 用 量
DNA 1 μL
BigDye 4 μL
μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
灭菌去离子水 4 μL
总体积10 μL
测序PCR热循环条件：
96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环→ 4 °C保温
1/8反应体系（5 μL）：
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试 剂 用 量
DNA 1 μL
BigDye 1 μL
BigDye Seq Buffer (5 x) 0.5 μL
μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
μL
灭菌去离子水 1.5
总体积 5 μL
sdo100测序PCR热循环条件：
96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环→ 4 °C保温
3. 大分子量DNA模板测序
大分子量的DNA模板指BAC DNA、Cosmid DNA和细菌基因组DNA等。
标准反应体系（20 μL，96孔板）：
试 剂 用 量
DNA 1 μL
BigDye 8 μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
μL
灭菌去离子水10 μL
总体积20 μL
测序PCR热循环条件：
95 °C 5 min → (95 °C 30 sec → 50-55 °C 10 sec → 60 °C 4 min) x 50个循环→ 4 °C保温
1/8反应体系（5 μL，大分子量DNA模板的测序请慎用稀释体系）：
试 剂 用 量
DNA 1 μL
BigDye 1 μL
引物 (3.2 pmol / μL) 1
μL
灭菌去离子水 2 μL
总体积 5 μL
测序PCR热循环条件：
飞行模拟舱95 °C 5 min → (95 °C 30 sec → 50-55 °C 10 sec → 60 °C 4 min) x 50个循环→ 4 °C保温
土压力盒
4. 测序产物纯化：20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法
1. 每管加入2 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入2 μL 3M NaAc到管底。
2. 每管加入50 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。
3. 1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心
（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
4. 每管加入70 μL 70% 酒精，1650 x g 4 °C离心15 min；马上倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心（从
离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
5. 重复第4步1次。
6. 室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 °C保存。
7. 溶解后的样品需要在 95 °C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。
5. 测序产物纯化：10 μL反应体系，384孔板，酒精/EDTA/NaAc法
1. 每管加入1 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入1 μL 3M NaAc到管底。
2. 每管加入25 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。
3. 1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离
心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
4. 每管加入35 μL 70% 酒精，1650 x g 4 °C离心15 min；马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离心
（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。
5. 重复第4步1次。
6. 室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 °C保存。
7. 溶解后的样品需要在 95 °C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。
6. 测序产物纯化：单离心管法
请参照20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法操作，只需要将“倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心”这一操作改为用吸尽上清液。
7. 相关试剂
3M NaAc
注意NaAc 的pH值。BDT v1.0、v2.0 和 v3.0使用的是pH 4.6，而BDT v1.1 和 v3.1使用的是pH 5.2。
102.06 g NaAc·3H2O溶于< 200 mL dH2O中，用冰醋酸调pH至5.2，定容至250 mL，分装，高压灭菌，室温保存。
BigDye terminator v1.1 / v3.1 sequencing buffer (5x)
注意：BDT v1.0、v2.0 和 v3.0使用的是5 x sequencing buffer，而BDT v1.1 和 v3.1使用的是BigDye terminator v1.1 / v3.1 sequencing buffer (5x)，不可混淆。
BigDye Terminator v1.1 / v3.1 Sequencing Buffer (5x)
mL
4336697 1
mL
4336699 28
mL
4336701 233
5x Sequencing Buffer
4305605 1 tube, 600 rxns
4305603 9 tubes, 5400 rxns
豫公网安备41160202000603
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