一种用于胰腺纤维化的纳米制剂及其制备方法

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种用于胰腺纤维化的纳米制剂及其制备方法。

背景技术：

2.胰腺纤维化是慢性胰腺炎、胰腺癌等疾病重要的病理特征。当胰腺受到炎症刺激和外界损伤时，胰腺星状细胞会在炎症因子刺激下持续活化，并分泌大量胶原纤维，当胶原纤维产生过多，降解受阻，将导致纤维化胶原蛋白大量异常沉积，最终导致胰腺纤维化的发生。
3.胰腺星状细胞的激活在胰腺纤维化发生发展中均具有关键作用，近年来已有部分针对抑制胰腺星状细胞活化的药物受到关注。但由于胰腺体积较小，位置隐匿，药物靶向性和生物利用度均受到挑战。同时，在纤维化过程中大量沉积的胶原纤维形成病理性屏障，进一步阻碍的药物递送至胰腺内部，严重影响药物效果。
4.目前，利用脂质体进行亲/疏水药物的递送是常见的方法之一，且已有许多研究利用胶原酶修饰的纳米制剂通过增强胶原降解，促进药物向肿瘤内部的渗透，但尚未有胶原酶修饰的脂质体用于胰腺纤维化药物的靶向、消融和递送。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于胰腺纤维化的纳米制剂，可实现靶向递送抗纤维化药物至胰腺纤维化组织。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于胰腺纤维化的纳米制剂，包括脂质纳米粒，在脂质纳米粒表面连接有靶向i型胶原的胶原靶向肽和/或胶原酶；所述脂质纳米粒由嵌段共聚物x-peg-mal、磷脂和胆固醇b制成，其中x选自dspe、dppe、dmpe或dope，peg的分子量为1000-5000，mal为马来酰亚胺基团。
7.进一步地，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、大豆磷脂或合成磷脂（如dppd，dops，depe，dmpe，dspe，dppe，dope，dopg，epg，popg，dppg，dspg，dmpg，dppa，depc，dopc，dmpc，popc，dspc，dppc）。
8.进一步地，所述胶原酶为胶原酶i或胶原酶iii。
9.进一步地，所述脂质纳米粒包载有抗纤维化药物。抗纤维化药物为亲水性抗纤维化药物或疏水性抗纤维化药物，如全反式维甲酸、生育三烯酚、多酚、姜黄素、大黄酸、白藜芦醇、四硫代钼酸铵等。在本发明的一个实施例中，同时包载了游离全反式维甲酸和四硫代钼酸铵。
10.上述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，制备脂质纳米粒；步骤2，将脂质纳米粒与巯基化胶原酶和/或胶原靶向肽混合，制得所述纳米制剂。
11.上述纳米制剂在制备胰腺纤维化相关疾病药物中的应用。
12.本发明提供的抗胰腺纤维化药物纳米制剂，与现有技术相比具有以下优点：嵌段共聚物x-peg-mal和磷脂制成的脂质纳米粒可以很好的实现亲水性和/或疏水物的负载，载体上的胶原靶向肽可以靶向胰腺纤维化胶原沉积部位，载体上的胶原酶可以降解胰腺纤维化过程中中异常过度沉积的胶原蛋白（i、iii型胶原），载体中的peg可以延长载体的血液循环时间，通过此载体可大大提高药物的利用度。
13.本发明的胶原靶向肽及胶原酶修饰的纳米制剂，利用胶原靶向肽可以靶向胶原沉积的胰腺纤维化区域，利用胶原酶修饰消融穿透胰腺纤维化病程中形成的胶原屏障，为胰腺纤维化化学药物高效递送提供了一种新的途径。
附图说明
14.图1是本发明纳米制剂制备的流程示意图。
15.图2是纳米制剂药物/cc的粒径分布图。
16.图3是纳米制剂药物/cc的透射电镜图。
17.图4是纳米制剂药物/cc在各溶液中的稳定性。
18.图5是本发明所制备的纳米载体对mpscs和266-6细胞的细胞毒性。
19.图6是体外在胶原屏障存在时，所用mpscs细胞摄取包载香豆素6纳米制剂流式细胞仪定量分析。
20.图7为小动物活体成像显示包载荧光染料（dir）的不同制剂在各实验组胰腺纤维化小鼠胰腺的蓄积。
21.图8为在体内水平考察不同纳米制剂在逆转胰腺纤维化的效果分析。
具体实施方式
22.本发明利用胶原酶及胶原靶向肽修饰的脂质纳米粒，通过疏水性尾部实现疏水性抗纤维化药物的负载，亲水性内核实现亲水性抗纤维化药物的负载，通过peg实现纳米粒在体内的长循环，通过修饰的胶原靶向肽特异性靶向纤维化胰腺，通过胶原酶克服纤维化病理性胶原屏障，实现了抗纤维化化学药物的高效靶向递送。
23.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
24.实施例1纳米制剂成份的合成及制备一、包载药物的脂质纳米粒的制备采用薄膜分散法、注入法或反向溶剂法均可制备负载全反式维甲酸、四硫代钼酸铵或荧光染料（作为代替药物的模型，用于制剂追踪）的纳米制剂，原理如图1所示。
25.本实施例优选地采用薄膜分散法制备负载抗胰腺纤维化药物的纳米制剂。具体制备方法如下：称取30mg磷脂，5mg dspe-peg
2000-mal，5mg胆固醇和1.5mg 全反式维甲酸溶于
50ml二氯甲烷中，将圆底烧瓶通过旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均质的薄膜，使用溶解1mg/ml四硫代钼酸铵的pbs溶液进行水合，通过超声破碎仪，制备粒径均一的脂质体，利用离心以及g50纯化柱分别除去游离载体材料和未包封的药物。
26.二、巯基化胶原酶i称取100 mg i型胶原酶和2.75 mg 2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶于5 ml 0. 01m磷酸盐缓冲液中，室温条件下反应1h，葡聚糖凝胶柱（g-25）脱盐纯化，紫外（280nm）检测纯化溶液蛋白浓度，备用。
27.三、具有胶原靶向肽和胶原酶的脂质纳米粒制备将负载药物的脂质纳米粒与胶原靶向肽（lrelhlnnnc）和巯基化的胶原酶i按照质量比1:2共孵，室温条件下，0.01m磷酸盐缓冲液中反应过夜；利用超高速离心法（20w
×
g）离心收集沉淀，用适量pbs重悬，获得除去游离胶原靶向肽和巯基化的胶原酶i的最终制剂（药物/cc）。
28.同时，将负载药物的脂质纳米粒与胶原靶向肽（lrelhlnnnc）共孵（1mg /ml），室温条件下，0.01m磷酸盐缓冲液中反应过夜；利用超高速离心法（20w
×
g）离心收集沉淀，用适量pbs重悬，获得除去游离胶原靶向肽的制剂（药物/cbp）。
29.此外，将负载药物的脂质纳米粒与巯基化的胶原酶i共孵（2mg/ml），室温条件下，0.01m磷酸盐缓冲液中反应过夜；利用超高速离心法（20w
×
g）离心收集沉淀，用适量pbs重悬，获得除去游离胶原酶的制剂（药物/col i）。
30.利用上述方法所制备的药物/cbp、药物/col i，药物/cc载药量在2%-3%之间，粒径大小在100nm-200nm之间。
31.纳米制剂药物/cc的粒径分布、透射电镜图及纳米制剂稳定性如图2、图3、图4所示，该纳米制剂粒径分布均匀，并具有很好的形态；在pbs溶液、生理缓冲盐溶液、含有10%血清的dme/f2培养基中均具有良好的稳定性。
32.实施例2纳米制剂载体材料安全性的考察按照实施例1的方法制备未包载药物的脂质纳米粒（lip）、单接胶原靶向肽的脂质纳米粒（lip-cbp）、单接胶原酶i的脂质纳米粒（lip-col i）、接靶头及胶原酶i的脂质纳米粒（lip-cc），采用mtt法测定空载体对各种胰腺细胞（mpscs、266-6）的细胞毒性。
33.具体操作步骤如下：首先将对数生长期的细胞分别加入到96孔板中，每孔铺板密度是1x104/200μl.在细胞培养箱中培养24h。然后使用不含fbs的培养基将空载体稀释成一系列浓度梯度，并以不给予材料的细胞作为对照组，细胞给予的药物浓度分别为5、10、20、50、100 μg/ml，吸去96孔板中的培养基，然后每孔加入100 μl不同浓度梯度的样品，每个浓度重复5个孔。给药后继续培养24或48h，避光条件下加入20μl的mtt，细胞培养箱中继续培养4h。取出96孔板，用1ml注射器吸走上清液，加入150μl dmso，在37℃摇床中振摇10-15min，酶标仪490nm处检测各孔的od值，计算细胞生存率。
34.本实施例所测得的细胞毒性数据如图5所示，空载体lip、lip-cbp、lip-col i、lip-cc在100μg/ml浓度以内，对mpscs和266-6细胞均无毒副作用，证明本发明所使用的载体具有很好的安全性。
35.实施例3
mpscs摄取包载香豆素6纳米制剂流式细胞仪定量分析按照实施例1所述制备载香豆素6的脂质纳米粒（lip@c6）、单接靶头载香豆素6的脂质纳米粒（lip-cbp@c6）、单接胶原酶载香豆素6的脂质纳米粒（lip-col i@c6）、接靶头及胶原酶的载香豆素6的脂质纳米粒（lip-cc@c6）。将mpscs以8
×
104/ml接种于24孔板中，于37
°
c，5% co2细胞培养箱中贴壁生长24h后，吸去培养基，分别加入500μl lip@c6、lip-cbp@c6、lip-col i@c6，lip-cc@c6的不含血清培养基溶液，每组别设置三个副孔，以所含香豆素6的浓度为0.025mg/ml统一标准。继续培养6h，用pbs清洗三次,胰酶消化，2000rpm离心沉淀细胞，用不含血清的培养基重悬细胞，利用流式细胞仪对摄取的香豆素6进行定量检测。
36.本实施例所测得的细胞摄取数据如图6所示，在分泌胶原较多的mpscs中，香豆素/col及香豆素/cc的摄取明显高于其他组，证明胶原酶的接枝可以通过降解胶原的方式增加细胞摄取率。
37.实施例4包载荧光染料（dir）的纳米制剂在胰腺纤维化小鼠的胰腺蓄积按照实施例1所述制备载dir的脂质纳米粒（lip@dir）、单接靶头载dir的脂质纳米粒（lip-cbp@dir）、单接胶原酶载dir的脂质纳米粒（lip-col i@dir）、接靶头及胶原酶的载dir的脂质纳米粒（lip-cc@dir）。
38.采用4-6周龄的c57雄性黑鼠进行试验，使用雨蛙素腹腔注射6周（5mg/kg，6次/日，3次/周）构建慢性胰腺炎模型。将空白组，纤维化造模组的小鼠随机分配为5组，每组3只，分别通过尾静脉注射游离dir、lip@dir、lip-cbp@dir、lip-col i@dir，lip-cc@dir纳米制剂在尾静脉注射后的1h、3h、6d、9d、12d、24d利用小动物活体成像仪对小鼠进行活体成像。
39.本实施例中所制备包载荧光染料（dir）的纳米制剂在胰腺纤维化小鼠胰腺蓄积的小动物活体成像图片（图7a所示）及其定量分析（图7b所示）。在纤维化组中，纳米制剂在胰腺蓄积程度如下：lip-cc@dir＞lip-cbp@dir＞lip-col i@dir＞lip@dir＞游离dir，证明了胶原靶向肽和胶原酶的修饰有利于纳米制剂在纤维化胰腺部位的沉积。
40.采用4-6周龄的c57雄性黑鼠进行试验，使用雨蛙素腹腔注射6周（5mg/kg，6次/日，3次/周）构建慢性胰腺炎模型。将纤维化造模组的小鼠随机分配为6组，每组8只，分别通过尾静脉注射pbs、游离全反式维甲酸（a）和四硫代钼酸铵（t）、载双药的脂质纳米粒（at）、单接靶头载双药的脂质纳米粒（at-cbp）、单接胶原酶载双药的脂质纳米粒（at-col i）、接靶头及胶原酶的载双药脂质纳米粒（at-cc）进行（3次/周，3周）。结束后解剖，通过h&e染评估纤维化改善程度。
41.本实施例中所制备的包载两种药物的不同纳米制剂胰腺纤维化后，胰腺组织学变化如图8所示。证明，后胰腺组织均出现不同程度纤维化修复，其中药物/cc纳米制剂组显示出最优的纤维化修复。
42.功能化磷脂包括dspe，dppe；天然磷脂包括蛋黄卵磷脂，氢化大豆卵磷脂及大豆磷脂及各类合成磷脂是常见的具有良好生物相容性的疏水嵌段，常在双亲性嵌段共聚物中作为疏水性内核，对大多数的具有一定疏水性的药物具有较好的亲和力。在上述实施例中，利用dppe-peg-mal嵌段共聚物代替dspe-peg-mal嵌段共聚物，用蛋黄卵磷脂和大豆磷脂代替大豆卵磷脂同样可以负载具有一定疏水性的药物，形成聚合物纳米粒的目的，对于本领域技术人员来说，是清楚的。
43.本发明的纳米制剂可同时负载有多种抗胰腺纤维化药物，首先借助胶原靶向肽靶向胰腺纤维化胶原大量沉积的胰腺组织，然后通过胶原酶消融降解穿透纤维化胶原屏障，进而实现高效靶向递送抗胰腺纤维化药物，从而达到高效逆转胰腺纤维化的目的。本发明首次通过构建靶向、消融、递送为一体的载体平台，来克服胰腺部位药物靶向蓄积的难题，促进潜在药物的渗透和蓄积，为抗胰腺纤维化药物的高效递送提供了一种新的途径和策略。
44.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种用于胰腺纤维化的纳米制剂，其特征在于：包括脂质纳米粒，在脂质纳米粒表面连接有靶向i型胶原的胶原靶向肽和/或胶原酶；所述脂质纳米粒由嵌段共聚物x-peg-mal、磷脂和胆固醇b制成，其中x选自dspe、dppe、dmpe或dope，peg的分子量为1000-5000，mal为马来酰亚胺基团。2.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、大豆磷脂或合成磷脂。3.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述胶原酶为胶原酶i或胶原酶iii。4.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述靶向i型胶原的胶原靶向肽的序列为lrelhlnnnc。5.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述纳米载体包载有抗纤维化药物。6.根据权利要求5所述的纳米制剂，其特征在于：所述抗纤维化药物为亲水性抗纤维化药物或疏水性抗纤维化药物。7.权利要求1-6任一项所述的纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，制备纳米载体；步骤2，将纳米载体与巯基化胶原酶和/或胶原靶向肽混合，制得所述纳米制剂。8.权利要求1-6任一项所述的纳米制剂在制备胰腺纤维化相关疾病药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种用于胰腺纤维化的纳米制剂及其制备方法，所述纳米制剂包括脂质纳米粒，在脂质纳米粒表面连接有胶原靶向肽和/或胶原酶；所述脂质纳米粒由嵌段共聚物X-PEG-Mal、磷脂和胆固醇B制成。本发明的胶原靶向肽及胶原酶修饰的纳米制剂，利用胶原靶向肽可以靶向胶原沉积的胰腺纤维化区域，利用胶原酶修饰消融穿透胰腺纤维化病程中形成的胶原屏障，为胰腺纤维化化学药物高效递送提供了一种新的途径。种新的途径。种新的途径。