功能性食品
王琳，隋昌海
(吉林工程职业学院生物工程学院，吉林四平136000)
摘要：利用大孔树脂法分离纯化黑米花昔。考察树脂类型、洗脱液乙醇浓度、上样液的浓度、洗脱液的流速等因素对分离纯化效果的影响，确定了大孔树脂法分离纯化黑米花昔的工艺条件：选用D101大孔树脂、乙醇洗脱液的体积分数60%、上样液中花昔的质量浓度12.0mg/mL、上样液pH3.0、洗脱速度3.5mL/min、D101大孔树脂上样液中花昔最大量7.2mg/g。在此条件下，经大孔树脂分离纯化后所得纯化物中花昔的纯度达到62%，证明利用D101大分离黑米花昔的方法可行。
关键词：黑米花昔；大孔树脂；分离纯化
Slrdy on seearation and puritcation of antdocyanins
from blach ricc by macroporous resin
WANG Lit,SUI Chang-fai
(Biological Engineering Deeartmeet,Jilin Engineering Vocational College,Siping136000,Jilin,China) Abstract:Using macapoaus resin to separate and purify the anthocyanins in black/co.The eXects of ewomacoopooou=oe=on=eype=,eheeoueoon ooquod o ee ehano oconcen eoa eoon,ehe=amp oe concen eoa eoon,ehe eoueoon speed,and oeheooneouenceeaceooson puooeocaeoon weoeseudoed.Theopeomum sepaoaeoon condo-eoonsoeanehocyanonson boack ooceusongmacoopooousoeson weoeaseo o ws：eypeoemacoopooousoeson was D101,the volume concentration of ethanol elution was60%,the sample concentration was12.0mg/mL, pH was3.0,elution speed was3-5mL/min,and the sample amount was7-2mg/g macapoaus asin.
Afer separation and puri/cation b-macapoaus resin with the optimum conditions,the putty of nthocy-anins in extract was up to62%,which indicated that b was feasible to separate and purify black rico an-ihocyanonswoih D101macoopooouso2son.
Key words:anthocyanins fam black rice;macapoaus resin;separation and purification
中图分类号：TS201.1文献标志码：A文章编号：1008-9578(2021)02-0104-05
黑米营养丰富，是一种特殊的稻米，因其含有成分而黑、深［1］'我《草纲目》中记载黑米具有“滋阴补肾、暖肝、目活血”等功。现代证明，黑米具有「人体有益的成分，其中人员所关注
的黑米有益成分之一，证其具有抗氧化、抗、理用［2—3］，因此黑米物质的
和分离纯化了一定的'目前大
树脂吸附法和逆谱泛用于，成分的分离纯化，其中大孔树脂吸附法具有稳定
性好、吸附量大、树类多，易于工业化转化等优点，应用于、、成的分离纯化［4—7］'利用大孔树离纯化黑米的研究少，侯方丽等［8］通过5种大树黑米花的分离，确定了AB-8大树
佳。在此基一析了D101和AB-82大树黑米的离，了洗的数、液质量浓度、洗黑米离纯化的，从
而定大树离化黑米的优工艺条件，为黑米的利用提供基础'
1与
1.1试验材料
黑米，市售;ABP大孔吸附树脂、D101大孔吸
收稿日期：2020-03-17
作者简介：（1982—），女，硕士，讲师，研究方向为生物技术。
通信作者：海（1981—）,，博士，副教授，研究方向为长白山作物资源开发与利用（
附树脂，东鸿化工有限公司；矢车菊素丁-葡萄糖昔标准品，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、盐酸等，均为分析纯'
1.2仪器和设备
TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;PHS-CC型pH计，上海精密科学仪器有限公司;THZC2A型气浴恒温振荡器，上海医疗生物仪器股份有限公司。
1-3黑米花昔浓缩液的制备
称取黑米适量，以体积分数50%的乙醇为提取溶剂，固液比为1：20(g/mL)，温度为70C，水浴振荡提取20mN，提取2次。合并2次提取液，在60 C下减压浓缩制成浓缩液，并根据试验需要进行稀释或用盐酸/氢氧化钠溶液调节pH[9]o
1-4花昔分离纯化条件的筛选
1.4.1树脂的筛选
1.4.1.1吸附
分别取活化好的ABC和D101大孔树脂，用滤纸吸干多余水分，每种树脂称取2a。准确吸取1-0mL样品浓缩液用蒸憎水定容到100mL得稀释样品液。将100mL稀释样品液倒入树脂中，在温度25C、振荡速度120r/min的条件下振荡5h，每
0.5h测定稀释液吸光度，绘制吸附曲线。
1.4.1.2解吸
吸附完毕后，将上述稀释样液滤出，以蒸J水反复冲洗，后将100mL的体积分数为60%的乙醇加入到吸附后的树脂中，在25C下，振荡解吸3.5h，每0.5h测定解吸液吸光度，绘制解吸曲线。
1.4.2解吸液乙醇浓度的筛选
称取5份选定的大孔树脂各2g，分别加入浓缩后的提取液各3.0mL、蒸J水40mL，充分吸附6h 后将样液滤出，以水冲洗树脂后分别加入水或体积分数为60%(70%(80%(90%的乙醇40mL，在25C、振荡速度为120r/min的条件下进行解吸，每
0.5h测定其吸光度，绘制解吸曲线。
1.4.3上样量的筛选
取10g预处理好的树脂，湿法上柱。将pH 3.0、质量浓度0.60mg/mL的稀释样品液缓慢注入吸附柱中，以2.5mL/min的速度流出，每4min收集一次，并测定其吸光度值。当流出液的质量浓度达到初始液质量浓度的10%时，则达到大孔树脂柱的泄漏点。以上样量及流出液的吸光度为横坐标和纵坐标绘制泄漏曲线。
1.4.4样液质量浓度对动态吸附效果的影响
取10g预处理好的树脂，湿法上柱。分别取浓缩液2.5mL，稀释成质量浓度分别为3.0、6.0、9.0、12、15mg/mL，pH为3.0的上样液，上样后静置0.5h，用20mL蒸J水冲洗后，再用50mL体积分数60%的乙醇洗脱，流速为2.5mL/min，收集流出液以及洗脱液并测定其吸光度值。
1.4.5液pH对态附果的影响
取10g预处理好的树脂，湿法上柱。取5份2.5mL浓缩液，分别加入20mL jJ水，调节pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，以2.5mL/min的流速上样，静置0.5h后再用20mL jJ水冲洗，后以50mL的体积分数为60%的乙醇进行洗脱，流速为2.5mL/min，收集流出液及洗脱液并测定其吸光度值。
1.4.6洗脱液流速对动态解吸效果的影响
取10g预处理好的树脂，湿法上柱。取2.5mL 浓缩液，分别加入20mL蒸J水，调节pH为3.0，上柱，静
置0.5h后用20@-蒸憎水冲洗，再用50mL 体积分数为60%的乙醇分别以1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mLLmon的洗，集洗液测定其吸光度值。
1.5附解
吸附率=S；S x100%(1)
1
解吸率=S S S x100%(2)
12
式中：S为吸附前样液中花昔的质量浓度, mg/mL;^2为吸附后流出液中花昔的质量浓度, mg/mL;S3为洗脱液中花昔的质量浓度,mg/mL。
1.6黑米花昔纯化物纯度的测定
标准曲线的绘制：以含2%的盐酸乙醇溶液为溶剂，配制质量浓度为0-25mg/mL矢车菊素丁-葡萄糖昔标准溶液，摇匀备用。按照文献[9]绘制标准曲线，得回归方程：Q=18.412"-0.0269,"单位为m/mL,@2= 0.9988，线性范围为0.0025~0.0050mg/mL。
纯度测定：称取纯化物0.05g置于50mL容量瓶中，盐酸乙醇溶液定容，适当稀释后按照标准曲线方法测定和计算，花昔纯度计算公式如式(3)。
式中:C为稀释液中花昔质量浓度,mg/mL;A为样品定容体积,mL;＜为样液稀释倍数;？为样品质量，g。
2结果与分析
2.1的选
由图1可知：在2.5h之前,2种大孔树脂对花
的吸附率逐渐增大，在3h基完成对目标离成分的吸附，且两树脂对黑米吸附性能差异不大。
由2：随的延长，D101和AB-82大树的吸率渐，2h 基本完成解吸。2大树脂的吸率
为82%和74%，由基于的解吸效，D101大孔树脂优于AB-8大树脂。综两种大树的吸附和吸，D101
98r
42-
28-
14-—AB-8—M—D101
°0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
时间/h
图22种大孔树脂静态解吸曲线
利用解吸液可以将大孔树脂所吸附的目标分离物质洗来，目标分离物质的。解吸液数会直接目标分离物质的洗:，而黑米的。由3：当数增大时，解吸率随之增大。当体数为50%，的吸率为75.4%；当乙数为60%，的吸率为76.3%；
大数吸率小。因此，确定以数60%的为解吸液。
定型布
2.3量的
0.00~_|_|~I_|~_~~_~|_|_|__I_~_
105090130170
上样量/mL
图4动态泄漏曲线
大孔树利用自身与被吸附的范德华力相用，以它较大的比表面积来吸附筛选相应的物质〔⑹。当吸附量饱和时，会超过大树脂的吸附能力。黑米量对大孔树的曲线如图4。由4：随量的力口，吸附 液的吸光度值随之逐渐增大，当量120nL时，吸光度为0.07，始质量浓度的10%，在120mL之后随量的增大，液的吸光度值力口。因，120mL为最大，即当样液中含有的总量为72.0n/时，10/D101大孔树脂的。
2.4上样液质量浓度的确定
液的质量浓大孔树脂完成分离纯化过程的一个重要因素。液的质量浓度过大会离物质没有被树脂吸附完全就从其中
；而当质量浓度过小时，虽然树了充分的吸附，则会变大，延长了出寸，因择的液质量浓离纯化效率的重要因素。液质量浓吸附率的5。由，吸附率随液质量浓度的增大大小的。当液质量浓12.0mgLmL，黑米的吸附率大值78.6%。液质量浓度超过12.0m//mL时，大树脂的吸附率变小。能是
液质量浓的大液在没有大树充吸附，从中从而模杯
吸附率
静水天平
，因 疋上样液 质量浓度为12.0 my/mL o '
3
6 9 12 15
上样液花昔质量浓度/ (mg/mL)
图5上样液花•浓度对吸附率的影响
2- 5 上样液pH 的确定
图6
pH 对吸附率的影响
由于 在不同pH 条件下离子状态不同,
所以 液的pH 对大孔树 离纯化 有很
大的 。由6 ：随 pH 的变化， 吸
附率 大 小，当 液pH 于3.0时，大孑L 树 黑米 的吸附率 , 78.6 %。当
pH 大于3.0时，随 pH 的增大，大 树脂的吸附
率有所下降，因
液的pH 选择3.0o
2.6 洗脱液流速的确定
2J 8.o .O 1- O
8 879.
2.5
3.5
4.5
5.5
洗脱液流速/ (mL/min)
图7洗脱液流速对黑米花•解吸率的影响
洗 的 会 目标分离物质解吸率
的大小。洗液
过快会 大孔树脂没有解吸完全时，洗 液
，从而使解吸率 ；
洗脱液 过 ，会 吸 的延长，因
需选择 的洗脱液 。由7
：随
洗脱液
的增加，
吸率 大 小。
当洗脱液
为3. 5 mL/min 时，吸率
大值
81.8 %。
大洗脱液 会使
吸率
毛刷制作降低，由此确定 洗脱液
为3.5 mL/min 。
根 述 结
定黑米花苛分离纯化
条件：选用*101大孔树脂、上样液pH 3.0，洗脱液
的 数 60 %、洗 3.5 mL/min 、上
液中花苛的质量浓度12.0 my/mL o 在此条件下，
D101大 树
大吸附量为72. 0 my/g o
2.7 黑米花昔分离纯化结果
按照上述所得黑米
大孔树 离纯化
条件，放大3 3
证 。取30 g
处理后的D101树，通过湿
，以述确定
条件
离纯化。洗液 ， 干黑米
化物，经测定
其花
为62 %。由 证明：此工 条件可以提高 化物中黑米 的 ，具备 性。
3结论
定了大孔树
离纯化黑米 ，
苛的工艺条件。通过静态吸附和解吸效垛D101和AB-8 2种树
的吸附和解吸性
能，经过综 析 定*101大 树脂用于
黑米
的分离纯化。通过静态解吸
析不 数的
的 吸
定
用
数为 60 % 的 液 为洗 液。 通
过 态
量、
液质量浓 、 液 pH
以及洗脱液 大孔树
离纯化黑米，苛
的 ，确定1 y 的D101大 树脂的
大上
样量为7. 2 my 、洗脱速度为3- 5 mL/min 、上样液中
花苛的质量浓度为12.0 my/mL 。按照此条件进
黑米
的 离 化， 所 化物中 的62 %。 证，利用大孔树
离纯
化黑米 以 的 ， 为黑米
的进一
利用 。
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(下转第112页
)
表5响应面试验结果方差分析
方差来源方和自由度方<；值5值显著性
模型6.4590>7258>32<0>0001
**
F0.6310>6351>480>0002** G0.0610>064>700>0668
C0.2910>2923>180>0019** AB0.2410>2419>130>0033** FC0.4110>4133>320>0007** GC 1..23v10_311>23v10-30>100>7615
F23>37
13>37273>74<0>0001** G2 1..44v10_311>44v10-30>120>7421
C21>2211>2299>50<0>0001
**
残差项
0>08670>012
失拟项
检查井盖
0>0330>010>720>5901
差项
0>05640>014
总和
6>5416
0>9128
0>9699
注：“*”表示差异显著（5<0.05）；“**”表示差异极显著（5< 0.01）
量22.80g/250mL（蛋白Z添加量0.5g/L、接种量为13.07mL/100g干基。在此发酵条件下0-胡萝卜素理论产量为2-59mg/kg干基。在此工艺条件下进行验证实验，通过平行试验得到0-胡萝卜素产量为2.71mg/kg干基，与响应面预测出的理论值比较接近，认为该模型有效。
3结论
通过单因素试验确定锁掷抱酵母S3-1产0-胡萝卜素固态发酵条件：啤酒糟：豆粕=3：7、蛋白Z添加量
1g/L、装料量20g/250mL、接种量10mL/100g干基、初始pH5.0、培养基含水量55.0%、发酵温度30.0C、发酵时间84h。对单因素试验进行分析到影响因素最大的3个因素（装料量、蛋白Z添加量、接种量）进行响应面试验，得到了该试验的最佳条件：装料量22.80g/250mL、蛋白Z添加量0.5g/L、接o・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・oo・o<（上接第107页）
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