研究简报
文章编号:1001-8689(2007)09-0572-03
大孔吸附树脂分离发酵液中乳链菌肽的工艺研究Nisin extraction process from the fermentation broth with macro -porous absorbent resin
王晖 胡滨* 吴兆亮 宫立鹏*
Wang Hui, Hu Bin, Wu Zhao-liang and Gong Li-peng
(河北工业大学生物工程系, 天津300130
(Depar tment of Bio engineer ing Hebei U niv er sity o f T echnolog y, T ianjin 300130)
摘要: 以大孔吸附树脂D 3520和D 4020为吸附剂，可有效的吸附发酵液中的乳链菌肽(nisin)。在30℃、pH2.5时，吸附剂用量为60m l 发酵液/g 干树脂时,D 3520和D 4020对发酵液中nisin 的吸附率可达90%。滤去吸附残液，对于D 3520型树脂，解吸剂用量为30ml /g 干树脂，用80%乙醇洗脱，最大静 态解吸率为63%；对于D 4020型树脂，解吸剂用量为40ml /g 干树脂，使用60%乙醇洗脱，最大静态解吸率为65%。
关键词: 大孔吸附树脂; 吸附; 解吸中图分类号:T Q 920.6 文献标识码:A
收稿日期:2006-03-27 修回日期:2006-06-13
作者简介：王晖，女，生于1982年，硕士。 *通讯作者,E-mail:hubin@heb ut.edu
乳链球菌肽(nisin )是一种由乳酸乳球菌代谢产生的具有很强杀菌作用的代谢产物，具有高效、安全、无毒的特点，是目前国际上唯一允许商业化生产的天然食品防腐剂[1]，目前工业上用发酵法生产乳链球菌肽。对乳链菌肽的分离纯化方法有盐析，有机溶剂萃取以及近年来发展起来的凝胶层析[2]
、聚丙烯酰胺凝胶盘装电泳、免疫亲和层析、泡沫分离法等，但由于有机溶剂的加入使后续分离工作变得复杂，或由于其工艺复杂成本高，工业化大规模生产比较困难。国外有使用吸附解析法分离纯化发酵液中乳链菌肽的报道[3]
，但吸附剂价格较贵难以应用于国内的工业化生产。大孔吸附树脂是一类新型的非离子型高分子化合物。它在分离生物活性物质中应用比较广泛，但在国内分离乳链菌肽的性能上尚未见报道。本论文以分离和提纯发酵液中乳链菌肽为目的，选用D 3520和D 4020两种大孔吸附树脂对乳链菌肽进行吸附特
性的研究，通过两种树脂对乳链菌肽的饱和吸附、静态吸附、动态吸附、解吸试验，绘制吸附动力学曲线、穿透曲线及脱附曲线，研究确定D 3520、D 4020树脂是分离提纯乳链菌肽的较佳吸附剂。为今后用大孔树脂吸附分离发酵液中的乳链菌肽的工业化生产提供了实验基础。1 材料与方法1.1 材料
经0.2L m 陶瓷膜预处理的乳链菌肽发酵液(天津康益生物工程有限公司提供);D3520和D4020型大孔吸附树脂(南开大学化工厂)；无水乙醇(天津市文达稀贵试剂化工厂)；吸附柱26mm ×400mm 。1.2 方法蕲蛇酶注射液
(1)生物法测定效价 采用二剂量琼脂扩散法。(2)树脂静态、动态操作 静态吸附与解吸在恒温水浴摇床上进行，测定原液、残液的效价，计算的静态吸附量、解吸率。动态吸附在吸附柱中于室温下操作，吸附柱出口流出残液定时收集。测定效价，计算吸附率。
2 结果与讨论2.1 吸附树脂筛选
各种树脂预处理后进行静态吸附试验，结果见表1。
试验条件:0.5g 干树脂,30m l 发酵液,30℃恒温振荡2.5h 各树脂的规格如表2所示。
从表1中可见D 3520和D 4020大孔树脂的吸附量达到了90%以上，故选择这两种树脂进行试验。2.2 两种树脂对乳链菌肽的静态吸附动力学曲线从图1可见，树脂吸附动力学过程为：两种树脂的起始瞬
间吸附速率较高，属单分子层吸附，快速地达到吸附平衡，在吸附2.5h 时基本达到吸附平衡，之后吸
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572・中国抗生素杂志2007年9月第32卷第9期
表1 不同大孔吸附树脂的静态吸附率树脂类型吸附率(%)树脂类型吸附率(%)
D352095.70AB-874.68
D402092.50X-541.40
D400634.06
表2 各树脂规格一览表
树脂型号极性粒径范围
(mm)
比表面
无机粘结剂
(m2/g)
平均孔径
(nm)
孔容
(m l/g)pcba检测设备
D3520非极性0.3～1.25480～52085～90 2.10～2.15 D4006非极性0.3～1.25400～44065～750.73～0.77 D4020非极性0.3～1.25540～580100～105 2.88～2.92 X-5 非极性0.3～1.25500～600290～300 1.20～1.24 AB～8弱极性0.3～1.25480～520130～1400.73～0.77
附量增加缓慢。从吸附量和时间的关系来看，两种树脂的吸附性能是比较好的。
2.3 动态吸附
两种树脂的动态吸附曲线如图2所示。从图中看出，吸附曲线在吸附开始一段时间时有一急剧上升，由图确定D4020型树脂的穿透时间为28min,28.75h 达到穿透平衡,D3520型大孔树脂的穿透时间为27.5
min,29.75h达到穿透平衡。实际工业生产中在达到穿透点时停止吸附操作，转入吸附质洗脱和吸附剂再生或多级吸附操作。
2.4 静态解吸
乙醇作为一种有机溶剂，具有廉价、易得、易分离、对人体的毒害较小等优点，并且有大量文献报道乙醇作为解吸剂对蛋白质、多肽的解吸，故认为是一种合适的解吸剂。不同浓度的乙醇的解吸效果如图所示。
由图3可知，乳链菌肽在乙醇中的解吸率随时间延长而增大，当解吸8h后，解吸基本上达到平衡，解吸率不再增大。由此确定解吸时间为8h。由图4看出，对于D3520型树脂，当乙醇浓度为80%时，其有最大的解吸率(63%)；对于D4020
型树脂，当乙醇浓度为60%
时，其有最大解吸率(65%)
。造成解吸率低的原因可能
由于乳链菌肽是一种生物活性物质，有机溶剂等对其
活性都有影响。由于乙醇沸点较低，故从解吸液中分离
乳链菌肽可采用蒸馏的方法，馏出乙醇可循环使用，降
橡胶发泡鞋底
低成本。
3 小结
(1)用大孔吸附树脂分离发酵液中的乳链菌肽乳
1:D3520;
2:D4020
洗衣机面板图1 发酵液吸附动力学曲线
1:D3520; 2:D4020
图2 D4020型及D3520型大孔树脂动态吸附曲线
1:D3520; 2:D4020
图3 解吸量随时间变化曲线
1:D3520; 2:D4020
图4 不同浓度乙醇解吸曲线
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大孔吸附树脂分离发酵液中乳链菌肽的工艺研究 王晖等
链菌肽是可行的,D3520、D4020是合适的吸附树脂，乙醇是较好的洗脱剂。
(2)确定了两种树脂对乳链菌肽静态、动态吸附及静态解吸的最优化操作条件，吸附温度为30℃, pH2.5，吸附剂用量为60ml发酵液/g干树脂,3h达到静态吸附平衡。使用乙醇为解吸剂,D3520型树脂的乙醇浓度为80%，用量30m l/g干树脂;D4020型树脂的乙醇浓度为60%，用量40ml/g干树脂。
(3)与其它分离纯化方法相比，用大孔树脂分离纯化的方法简便易行、分离纯度高、安全无毒害，是一种有效的分离手段。
参考文献
[1]Stev ens K A,Sheldo n B W,K lapes N A,et al.N isin
tr eatment fo r ina ct ivat ion o f Salmonella species a nd ot her
g ram-negative bacteria[J].Ap p l Envir on M icrobiol,
1991,57(12):3613～3615.
[2]Cheigh C I,K oo k M C,Kim S B,et al.Simple one-step
purificatio n of nisin Z fro m unclar ified cult ur e br oth o f L actococcus lactis subsp.lactis A164using ex panded bed ion ex cha ng e chro matog r aphy[J].Biotechnol L ett,2004, 26(17):1341～1345.铃木秀一
[3]T olonen M,Sar is P E J,Siika-aho M.Pr oduct ion of nisin
w ith co ntinuous adso rption to A mberlit e XA D-4r esin using L actococcus lactis N8and L.lactis L AC48[J].A p p l M icrobiol Biotechnol,2004,63(6):659～665.
(上接第555页)预处理时也采用了含有乙腈的流动相来沉淀去除胆汁中的蛋白等杂质。结果胆汁中美罗培南出峰干净利落，峰形良好，分离完全，无杂峰干扰。该处理方法较其他方法(如蒸馏、浓缩、吸附法)明显简便，快捷，也使本测定方法有更强的专属性。本研究采用外标法峰面积定量，经济简便，且回收率和精密度高，具有高效、快速、准确、灵敏度高、重现性好的优点，可作为美罗培南的胆汁药物浓度测定和药动学研究的可靠检测方法。
参考文献
[1]郑惊雷，梁力建，赖佳明.胆道感染病原菌及其对抗生素敏
感性变化的研究[J].中国实用外科杂志,2005,25(2):86～88.
[2]刘松青，林彩，代青，等.HP LC法测定人血清及尿中美洛
培南浓度[J].中国抗生素杂志,2003,28(9):526～528. [3]郑惊雷，梁力建，黄文静，等.头孢曲松钠在胆汁中的浓度
测定和药动学的实验研究[J].中国药学杂志,2005,40
(20):1569～1571.
[4]W estphal J F,Br og ar d J M.Biliar y tra ct infect ions——A
g uide t o drug treat ment[J].Dr ugs,1999,57(1):81～91.
[5]M endez A S,W eisheimer V,O ppe T P,et al.M icr obio-
log ical assay fo r the det erminat ion o f mer openem in phar-maceutical do sage fo rm[J].J Phar m Biomed A nal,2005, 37(4):649～653.
[6]殷果，李玉兰，邓颖，等.旋光法测定注射用美罗培南的含
量[J].医药导报,2004,23(11):865～866.
[7]M r estani Y,Neuber t R,N agel F.Capillary zone elec-
tr ophor esis det erminat ion o f mer openem in biolo gical media using a hig h sensitivit y cell[J].J Phar m Biomed
A nal,1999,20(6):899～903.
[8]R obatel C,Buclin T,Ecker t P,et al.Deter mination o f
mer openem in plasma and filt rate-dialy sate fro m patients under continuo us veno-venous haemo diafiltrat ion by SP E-L C[J].J P harm B iomed A nal,2002,29(1):17～33. [9]徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学(第三版)
[M].北京：人民卫生出版社,2002,740～742.
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574
・中国抗生素杂志2007年9月第32卷第9期
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