赭曲霉毒素A完全抗原的制备及鉴定
周景明;李春革;祁艳华;张罗莎;张改平;王爱萍
【摘 要】赭曲霉毒素A(OTA)是一种对人和动物具有广泛毒性的霉菌毒素,为建立OTA在食品和饲料中的快速检测方法,采用活性酯法(NHS)将OTA与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,分别制备了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA.紫外扫描和SDS-PAGE鉴定表明,OTA与BSA和OTA与OVA偶联成功,偶联物OTA-BSA和OTA-OVA的偶联比分别为7∶1和4.5∶1.用免疫原OTA-BSA免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,用OTA-OVA包被ELISA板进行检测,小鼠血清中抗OTA的抗体效价最高可达1∶51 200.表明制备的免疫原OTA-BSA具有良好的免疫原性,为OTA单克隆抗体的制备奠定了基础. 【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2016(037)001
【总页数】5页(P38-42)
【关键词】大蒜破瓣机赭曲霉毒素A;活性酯法;完全抗原;多克隆抗体
siro-1967【作 者】周景明;李春革;祁艳华;张罗莎;张改平;王爱萍
【作者单位】郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;郑州大学生命科学学院,河南郑州450001;郑州大学生命科学学院,河南郑州450001
【正文语种】中 文
【中图分类】Q949.32
赭曲霉毒素(ochratoxin)是由曲霉菌属(Aspergillus)和青霉菌属(Penicillium)的某些种产生的二级代谢产物，包含7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)最普遍且毒性最强。OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变等特性，对动物和人体健康有很大的潜在危害[1]。根据已发现的真菌毒素的重要性及危害性排序，OTA仅次于黄曲霉毒素而位列第2，国际癌症研究机构于1993年将OTA列为2B类致癌物[2]。因此,世界各国均非常重视对OTA的检测和控制，分别制定了相关的限量标准，以确保食品安全和消除国际贸易的技术壁垒。目前，用于检测OTA的方法主要有高效液相谱
法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、液相-质谱联用法(liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS)[3]、毛细管电泳-二极管列阵检测法、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay，GICA)等,其中免疫学方法以其快速、方便、成本低的优点成为较常运用的OTA检测方法之一[4]。
OTA分子质量为403.8u，属于小分子物质，具有免疫反应性，不具备免疫原性，必须与大分子物质偶联之后，借助大分子的T细胞表位才能刺激机体产生针对OTA的特异性抗体应答。本试验采用活性酯法，先将OTA转化成较活泼的中间体，然后与大分子物质偶联，分别获得免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA，并从紫外扫描、SDS-PAGE和动物免疫3个方面对制备的偶联抗原进行鉴定。
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 赭曲霉毒素(OTA)为Pribolab公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品；碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、乙醇均购自国药
集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝法蛋白含量测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG(G@M-IgG-HRP)为Abbkine公司产品；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器 TP-214分析天平为Denver公司产品；Mini-PROTEAN Tetra System电泳仪、Gel DocTM XR+ 凝胶成像系统、Immuno WashTM 1575微孔洗板机、iMARKTM酶标仪，Bio-Rad公司；NanoDrop 2000c分光光度计、Barnstead Nanopure超纯水仪，Thermo公司；CMAG HS4加热磁力搅拌器为德国IKA公司产品；H1650-W台式高速离心机为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；WD-9405B型水平摇床为北京市六一仪器厂产品；透析袋为北京索莱宝科技有限公司产品。
1.1.3 实验动物 3只健康雌性Balb/c小鼠，6周龄，郑州大学分子免疫学实验室自繁自养。
1.2 方法
1.2.1 偶联抗原的制备 称取1mg OTA溶解于2mL的无水四氢呋喃(THF)中，按照摩尔比OTA∶NHS∶EDC=1∶2∶4的比例分别加入NHS和EDC,于室温下避光剧烈摇动4h。活化后1000
0r/min离心15min，取上清，弃沉淀，挥发THF,残留物溶解于0.2mL的二甲基甲酰胺中，此为活化产物。称取10mg BSA,充分溶解于2mL 0.13mol/L NaHCO3溶液中，于4℃预冷。将活化产物缓慢滴加于BSA溶液中，室温避光缓慢摇动，偶联时间为4h。反应产物于0.05mol/L 的NaHCO3溶液中透析72h,去除游离的OTA以及其他小分子物质,透析结束后3000r/min离心10min，上清即为OTA与BSA的偶联物，置-20℃保存，备用。同法制备OTA-OVA偶联物[5]。
1.2.2 偶联物的浓度测定及鉴定
1.2.2.1 偶联物蛋白浓度测定 采用考马斯亮蓝试剂盒按照使用说明测定偶联物OTA-BSA和OTA-OVA的浓度。
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1.2.2.2 偶联物紫外扫描及偶联比鉴定 在特定波长范围内，根据偶联物偶联前后的特征吸收峰，分析吸收峰位置及吸收强度的变化，判断OTA与BSA、OVA的偶联效果。用PBS配制一定浓度的OTA(OTA标准品先用无水乙醇溶解，之后用PBS稀释)、BSA、OVA、OTA-BSA、OTA-OVA溶液，在200nm～800nm范围内进行紫外扫描，判断偶联物偶联情况[6]。以OTA-BSA为例，分别测定OTA、BSA以及OTA-BSA在333nm、279nm处的吸光度值，
按照下面公式进行计算偶联比[7]。
K为物质在其最大吸收峰处的克分子消光系数，ρ为浓度，A为吸光度值，M为摩尔质量。
1.2.2.3 偶联物SDS-PAGE鉴定 对合成的偶联物进行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)分析，浓缩胶浓度为50g/L，电压设为90V，分离胶浓度为120g/L，电压设为120V。上样量为20μL，蛋白胶用考马斯亮蓝染液2h后，置于脱液中进行脱，直至蛋白条带清晰可见，根据结果判断是否偶联成功。
1.2.2.4 OTA-BSA免疫原性鉴定
(1)选取3只6周龄健康雌性Balb/c小鼠,用OTA-BSA进行免疫。免疫方式是皮下多点注射，免疫剂量为20μg/200μL/只，首免加弗氏完全佐剂，再次免疫均用不完全佐剂，首免3周后，进行第2次免疫，之后每隔2周免疫1次，共免疫4次[8]。末次免疫2周后，断尾采血并用PBS进行100倍稀释，3000r/min离心10min，分装并保存。
(2)多抗血清效价的检测。用碳酸盐缓冲液将OTA-OVA稀释为2μg/mL，50μL/孔包被于ELISA板上，4℃包被过夜。次日PBST洗板3次后，加入50mL/L猪血清进行封闭，200μL/
孔，37℃温育2h。PBST洗板3次，拍干封闭液。第1孔加入100μL 1∶100稀释的血清，其余孔加入PBS，50μL/孔，用多通道微量移液器从第1孔吸取50μL血清与第2孔铺底的PBS混匀后取50μL加入第3孔，以此类推进行倍比稀释，稀释到第10列为止；第11列加入阴性血清作为阴性对照，50μL/孔；第12列加入PBS作为空白对照，50μL/孔,37℃作用1h。PBST洗涤6次，加入1∶5000稀释的G@M-IgG-HRP,50μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗板6次，加入TMB显液，50μL/孔，显5min。然后加入2mol/L的硫酸终止显，50μL/孔，测定各孔的OD 450nm值,同时设立阴性(NC)对照和空白(BC)对照。以P/N≥2.1的血清最高稀释度作为该免疫血清的效价(P为待测孔的OD 450nm值，N为阴性对照孔的OD 450nm值)[9]。
(3)多抗血清敏感性的检测。检测血清多抗敏感性时按如前所述方法包被抗原后，抗原包被方法如前所述，第1孔加入640ng/mL的OTA标准品，之后用PBS倍比稀释,50μL/孔，然后每孔加入检测效价时OD 450nm值为1.0左右的稀释度的阳性血清，50μL/孔，最后留2孔做阴性对照和空白对照，37℃作用1h。PBST洗板6次，每孔加入50μL 1∶5000稀释的G@M-IgG-HRP，37℃孵育1h。PBST洗板6次，加入TMB显液，50μL/孔，显5min，加入2mol/L的硫酸终止显，用酶标仪读数，分析并保存数据。计算不同浓度OTA的抑制率，并制作标准曲线。抑制率=(1-B/B0)×100%(B0为不加OTA孔的OD 450nm值，B为加入不同
浓度OTA孔的OD 450nm值)，并计算IC50值[10]。
电加热反应罐
2.1 偶联物浓度测定结果
利用考马斯亮蓝试剂盒测得OTA-BSA浓度为2.94mg/mL，OTA-OVA的浓度为1.20mg/mL。
负压引流球2.2 紫外扫描及偶联物偶联比鉴定结果拼装家具
对OTA、BSA、OVA、OTA-BSA、OTA-OVA进行紫外扫描分析，结果如图1、图2所示。OTA在333nm处有特征吸收峰，BSA、OVA在279nm处有特征吸收峰，偶联物的最大吸收峰为379nm处，相对于OTA、BSA、OVA的峰值产生了一定位置的偏移与叠加现象，初步证明偶联物制备成功。进而得到OTA、BSA、偶联物在333、279、379nm处的吸光度值，根据1.2.2.2所示公式计算得出OTA-BSA的偶联比为7∶1，OTA-OVA的偶联比为4.5∶1。
2.3 SDS-PAGE鉴定结果
电泳鉴定结果见图3、图4。由图3和图4可知，偶联物OTA-BSA、OTA-OVA的条带比BSA
、OVA条带滞后，且有拖尾现象，证明偶联成功。由于BSA分子质量约为67ku,OVA的分子质量约为45ku,OTA分子质量约为0.403ku,偶联物OTA-BSA、OTA-OVA分子质量分别比BSA、OVA稍大，所以SDS-PAGE鉴定中泳动距离不明显。
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