提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂在制备抑制移植排斥反应药物中的应用

1.本发明涉及蛋白的功能与应用领域，具体涉及提高早期分泌性靶抗原6 蛋白表达量的试剂在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。

背景技术：

2.器官移植已经成为器官终末期病变的最有效手段，但移植手术后的排斥反应仍然是困扰器官移植的主要难题之一。传统免疫抑制剂的使用使早期移植器官失败的危险性大幅度下降，在抗器官移植排斥中发挥了巨大的作用，带来了巨大的经济社会效益。然而长期服用传统免疫抑制剂会导致严重的毒副作用，并增加患者发生感染、肿瘤等疾病的风险，因此并发症的出现使得现有的传统免疫抑制剂在预防和逆转移植排斥反应上的长期效果受到较大的影响。如何控制器官移植后的排斥反应，通过短期便能诱发移植物的长期存活或受体对移植物的免疫耐受，以减少免疫抑制剂药物的副作用，一直是移植免疫领域研究的重点。研究者们一直希望寻到一种新的有效的抗排斥反应的药物，以期能够降低副作用，减轻患者和社会的负担。

技术实现要素：

3.针对目前临床移植排斥反应药物的局限性，本发明的目的在于提供提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的一种新用途，即用于制备抑制移植排斥反应药物。
4.本发明通过以下技术方案实现：
5.根据本发明的第一个方面，提供了提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的新用途，即提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。
6.在一些实施方式中，提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分选自早期分泌性靶抗原6蛋白、早期分泌性靶抗原6dna、早期分泌性靶抗原6mrna中的至少一种。
7.早期分泌性靶抗原6(esat-6)是由约100个氨基酸残基构成的小分子分泌蛋白，是结核分枝杆菌早期培养或感染阶段产生的一种抗原，不存在于减毒株bcg及其他非致病分枝杆菌中，其氨基酸序列为 mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgse ayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa。本发明以balb/c小鼠为供体、c57bl/6小鼠为受体构建皮肤移植模型来研究esat-6的功能，发现esat-6能够显著延长皮肤移植物的存活时间，减少皮肤移植物中炎症反应和cd3
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t细胞的浸润，表明esat-6在抑制移植排斥反应方面的效果显著。此外，本发明还发现，将esat-6与雷帕霉素联用能够进一步延长皮肤移植物的存活时间，减少皮肤移植物中炎症反应和cd3
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t细胞的浸润，表明esat-6与雷帕霉素联用在抑制移植排斥反应方面的效果更加显著。
8.在一些实施方式中，药物包括提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂和药学上可接受的辅料。
9.在一些实施方式中，移植排斥反应包括皮肤移植排斥反应、同种异体器官移植排斥反应、角膜移植排斥反应、骨髓移植排斥反应、移植后的炎症反应。其中，同种异体器官包括心脏、肝、肾、肺、胰腺。
10.在一些实施方式中，药物的给药方式包括直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法。
11.根据本发明的第二个方面，提供了一种抑制移植排斥反应的药物，其包括提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂和雷帕霉素。
12.在一些实施方式中，提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分选自早期分泌性靶抗原6蛋白、早期分泌性靶抗原6dna、早期分泌性靶抗原6mrna中的至少一种。
13.在一些实施方式中，提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分为早期分泌性靶抗原6蛋白，药物中早期分泌性靶抗原6蛋白与雷帕霉素的质量比为(0.5-2.5mg/kg)：(0.5-1mg/kg)。
14.在一些实施方式中，还包括药学上可接受的辅料。
15.根据本发明的第三个方面，提供了上述的抑制移植排斥反应的药物在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。
附图说明
16.图1为动物实验中小鼠皮肤移植10天后移植皮片的存活情况。
17.图2为动物实验中小鼠移植后移植皮片的生存曲线图。
18.图3为动物实验中小鼠移植皮片的he染结果。
19.图4为动物实验中小鼠移植皮片的cd3免疫组化结果。
具体实施方式
20.下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。若无特殊说明，以下试验所用试剂均为市购，未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
21.1.实验动物
22.spf级balb/c小鼠和c57bl/6小鼠，体重：20
±
2g，周龄：8周，由广东省实验动物中心提供，雄性，自由饮食，温度为25
±
3℃，饲养在spf 级动物房。
23.2.动物分组
24.32只c57bl/6小鼠，随机分为4组，分为模型组(简称control组)、阳性对照雷帕霉素组(简称rapa组)(1mg/kg)、esat-6组(2.5mg/kg)、esat-6(2.5mg/kg)与rapa(1mg/kg)联用组(简称esat-6+rapa组)，每组8只。模型组为腹腔注射生理盐水，rapa组和esat-6组分别用生理盐水将雷帕霉素或esat-6配置成相应浓度，esat-6+rapa组为生理盐水配置成的esat-6和rapa的混合物，腹腔注射给药，隔天给药一次。
25.3.实验方法
26.(1)同种异体皮肤移植
27.将balb/c供鼠麻醉后取背部约1平方厘米的圆形皮瓣，于c57bl/6 受鼠背部剪去同等面积皮肤一块，形成一圆形创面，然后将供鼠皮瓣贴于受鼠创面，术区以无菌敷料包
扎，并用创可贴固定。移植后当天开始注射给药。若移植皮片变硬、融化脱落视为排斥；若移植皮片柔软、毛发生长、边缘融合则视为生长良好。记录移植皮片的存活时间。
28.(2)he染
29.在移植后第14天将小鼠处死，然后将移植皮片用10％多聚甲醛固定后进行脱水石蜡包埋，样品切片后进行苏木素和伊红染，然后用中性树胶封片，对染切片进行观察并拍照。每例标本随机选取5个视野分别记录炎症细胞浸润的情况。
30.(3)免疫组化
31.小鼠处死后将移植皮片用10％多聚甲醛固定后进行脱水石蜡包埋，然后3.5μm厚连续切片，进行脱蜡至水，抗原修复后孵育抗cd3抗体，利用 dab显方法检测cd3
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t细胞的数量，其表达阳性者在表皮和真皮见清晰棕黄颗粒沉积。在200倍镜下，每例标本随机选取5个视野，分别记录5个视野cd3
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t细胞表达的数据。
32.4.实验结果
33.(1)移植皮片存活情况
34.同种异体小鼠皮肤移植10天后移植皮片的存活情况如图1所示，从图 1可以看出，模型组受体小鼠的移植排斥反应明显，移植皮片的坏死程度达到90％；小鼠给予esat-6后，移植皮片的排斥反应显著减缓，移植皮片的坏死程度小于30％；与rapa组或者esat-6组相比，esat-6+rapa组小鼠的移植皮片的坏死程度更低。由此表明esat-6能够抑制皮肤移植排斥反应，将esat-6与雷帕霉素联用有更好的免疫抑制作用。
35.(2)移植后移植皮片的生存曲线图
36.小鼠移植皮片的生存曲线图如图2所示，从图2可以看出，受体小鼠给予esat-6后，移植皮片的存活时间显著延长(p《0.01)；与rapa 组或者esat-6组相比，esat-6+rapa组小鼠的移植皮片存活时间显著延长。由此表明esat-6能够延长皮肤移植物的存活时间，将esat-6与雷帕霉素联用能够诱导皮肤移植物的长期存活(p《0.01)。
37.(3)移植皮片的he染结果
38.小鼠移植皮片的病理检测结果如图3所示，从图3可以看出，受体小鼠给予esat-6后，移植皮片中浸润的炎症细胞显著减少；与rapa组或者esat-6组相比，esat-6+rapa组受体小鼠的移植皮片中炎症细胞浸润更少。由此表明esat-6能够减少皮肤移植物中炎症浸润，将esat-6与雷帕霉素联用对皮肤移植物中的炎症浸润有更好的改善作用。
39.(4)移植皮片的cd3免疫组化结果
40.小鼠移植皮片的cd3免疫组化结果如图4所示，从图4可以看出，受体小鼠给予esat-6后，移植皮片中浸润的cd3
+
t细胞显著减少；与 rapa组或者esat-6组相比，esat-6+rapa组受体小鼠的移植皮片中cd3
+ t细胞更少。由此表明esat-6能够抑制皮肤移植物中cd3
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t细胞的浸润，将esat-6与雷帕霉素联用对皮肤移植物中的cd3
+
t细胞有更好的抑制作用。
41.综上，esat-6能够显著延长皮肤移植物的存活时间，减少皮肤移植物中炎症反应和cd3
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t细胞的浸润，表明esat-6在抑制皮肤移植排斥反应方面的效果显著。将esat-6与雷帕霉素联用能够进一步延长皮肤移植物的存活时间，减少皮肤移植物中炎症反应和cd3
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t细胞的浸润，表明esat-6 与雷帕霉素联用在抑制皮肤移植排斥反应方面的效果更加显著。
42.以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不
脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分选自早期分泌性靶抗原6蛋白、早期分泌性靶抗原6dna、早期分泌性靶抗原6mrna中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包括提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂和药学上可接受的辅料。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述移植排斥反应包括皮肤移植排斥反应、同种异体器官移植排斥反应、角膜移植排斥反应、骨髓移植排斥反应、移植后的炎症反应。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法。6.一种抑制移植排斥反应的药物，其特征在于，所述药物包括提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂和雷帕霉素。7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分选自早期分泌性靶抗原6蛋白、早期分泌性靶抗原6dna、早期分泌性靶抗原6mrna中的至少一种。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂的活性成分为早期分泌性靶抗原6蛋白，所述药物中早期分泌性靶抗原6蛋白与雷帕霉素的质量比为(0.5-2.5mg/kg)：(0.5-1mg/kg)。9.根据权利要求6-8任一项所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。10.权利要求6-9任一项所述的药物在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。

技术总结

本发明涉及蛋白的功能与应用领域，具体涉及提高早期分泌性靶抗原6蛋白表达量的试剂在制备抑制移植排斥反应药物中的应用。本发明以BALB/c小鼠为供体、C57BL/6小鼠为受体构建皮肤移植模型来研究早期分泌性靶抗原6蛋白的功能，发现ESAT-6能够显著延长皮肤移植物的存活时间，减少皮肤移植物中炎症反应和CD3