1. 实验目的
掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。 2. 实验原理
从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。以电泳观点看，蛋白质
最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。如果在pH梯度
环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
凯膜过滤技术第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。在构象上，蛋白质－SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质－SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量。
单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联
形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。在SDS - PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。
3. 实验设备
明框玻璃幕墙垂直电泳仪，水平电泳仪，低温循环水浴，脱摇床，扫描仪，ImageMaster 2D platinum version 5.0软件。电泳仪及其配套制胶设备、脱摇床。
4. 实验试剂
（1）溶涨液：
8 mol/L Urea
2 % CHAPS
20 mmol/L DTT
0 .5 %或2 % IPG buffer
少许溴酚蓝
（2）平衡缓冲液储液：
50 mmol/L Tris (pH 8.8)
ca3660
视力保护器6 mol/L Urea
30 % 甘油
2 % SDS
少许溴酚蓝
（3）单体储液：
30 % （W /V）丙烯酰胺
0.8 % （W /V）甲叉双丙烯酰胺
（4）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris（pH8.8）。（5）浓缩胶缓冲液：1.0 mol/L Tris（pH6.8）。（6）SDS电泳缓冲液：
25 mmol/L Tris
192 mmol/L 甘氨酸
0.1 % SDS
（7）染液：
0.25 ％考马斯亮蓝R-250
45 ％甲醇
45 ％水
10 ％冰乙酸
（8）脱液：
45 ％甲醇
45 ％水
10 ％冰乙酸
（9）10 ％SDS
（10）10 ％的过硫酸铵。
5. 实验方法
（1）上样：一般采取加样品溶涨法，取大约30-60 μg 的蛋白与溶胀液混合，总体积为250 μL 。
（2）第一向等电聚焦：设置IPGphor 仪器的运行参数。工作温度20 ℃，每胶条最大电流50 μA ， 以下为电压设定情况：
将胶条槽平放于IPGphor 仪器上，与水平方向垂直，如是多个胶条槽注意相互平行
隐蔽式水箱
在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
蛋白与溶胀液混合物加入胶条槽
从酸性端去掉胶条的保护膜
放置胶条：胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极（尖端）方向放入胶条槽，慢慢下压，最后放下胶条碱
性端（平端），使溶液浸湿整个胶条，避免生成气泡。
（3）一向到二向胶条的平衡：
将胶条放入10 mL 平衡缓冲液Ⅰ中（含1 % DTT ）封口，在摇床上振荡15 min 。将胶条取出放入10 mL 平衡缓冲液Ⅱ中（含2.5 %碘乙酰胺）封口，在摇床上振荡15 min 。用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的液体。 （4）灌胶模具的安装：按仪器说明书装好灌胶模具，称之为“三明治”。
（5）凝胶浓度确定：根据预分离蛋白质相对分子质量范围确定需配置的凝胶浓度，主要指分离胶浓
度。
凝胶浓度 分离范围（KD ）
5 ％ 3
6 ~ 200 7.5 ％ 24 ~ 200 10 % 14 ~ 200 12.5 % 14 ~ 100 15 %
14 ~ 60
一般实验中多采用浓度10 ％或12.5 %的分离胶及浓度为5 ％的浓缩胶，制胶参照下表。 （6）灌注分离胶：按配比配制分离胶，配制完成后即可加入到制作好的制胶模具中，该过程需均匀
注入，防止产生气泡，同时动作要迅速。灌注一定量的分离胶后迅速注入水覆盖在凝胶溶液上层，将“三明治”充满。
电压（V ）
升压模式 电泳时间 电压（V ） 升压模式 电泳时间 30 Step-n-hold 12 hr 1000 Step-n-hold 1 hr 200 Step-n-hold 1 hr 8000 Gradient
3 hr 500
Step-n-hold
1 hr
（7）分离胶凝结后会形成清晰的胶平面，此时可参照浓缩胶配方配制浓缩胶。
（8）灌注浓缩胶：倒掉覆盖液，注入浓缩胶后立即插入梳子。待浓缩胶凝结后可上样。
（9）将固定制胶模具与底座的凸轮取下，用其将上层电泳槽与凝胶模具连接。按照顺序一次固定好
电泳设备。
（10）小心拔出梳子，将灌注好的制胶模具放入到盛有1Х SDS 电泳液的电泳槽中，然后在制胶模
具内注入1Х SDS 电泳液。
（11）上样：将准备好的样品加入到上样孔中。
上槽电泳液为新配制的， 约需1 L 下槽电泳液可为回收的电泳缓冲液，一般需4 L 。
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