聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 胶黏剂搅拌机溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）510152025304050
8%
水 2.3 4.6 6.99.311.513.918.523.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.74 5.3 6.7810.713.3 1.5 mol/L Tris
(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.03 10%
水 1.94 5.97.99.911.915.919.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.35 6.78.31013.316.7 1.5 mol/L Tris
(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 12%
量脚器水 1.6 3.3 4.9 6.68.29.913.216.5 30%丙烯酰胺溶液246810121620 1.5 mol/L Tris
(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 12.5%
水 1.5 3.1 4.65 6.37.89.412.515.66
30%丙烯酰胺溶液 2.1 4.2 6.258.310.412.516.720.84 1.5 mol/L Tris
(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 15%
水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.99.211.5 30%丙烯酰胺溶液 2.557.51012.5152025 1.5 mol/L Tris
(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02
表2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液
溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）123456810
5% 水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831 1.3 1.7 1.0 mol/L Tris
(pH6.8)0.130.250.380.50.630.7501.25 10% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.1 10%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.1 TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01
相关溶液贮液的配制
30% 聚丙烯酰胺贮液：
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙烯酰胺 4g
铝槽钢MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris-base pH8.8：
Tris碱 90.75g
MilliQ水 400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容
至500ml 4℃冰箱保存。
1.0mol/L Tris-base pH6.8:
贴片式led蒙砂膏
Tris-base 12.11g
MilliQ水 80ml
用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ 水定
容至100ml 4℃冰箱保存。
10% SDS：
SDS 10g
MilliQ水 100ml 混匀后，室温保存。
10% Ap：
Ap 0.1g
MilliQ水 1ml （用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。
10× 电泳缓冲液（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）：
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水 1L 混匀后，室温保存。
Loading buffer 2 × 4 ×
1.0M Tris-HCl PH6.8 1ml 2ml
甘油 2ml 4ml
10%(w/v) SDS 4ml SDS 0.8g
0.25%(w/v) 溴酚蓝 0.2ml 0.4ml
β-巯基乙醇 1ml 2ml
milliQ 水定容至 10ml 10ml
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制（10 ml）
组分：Tris-HCl pH6.8（60 mM）；SDS （2%）；溴酚兰（0.1%）；甘油（25%）；β-巯基乙醇（14.4 mM）
配制过程：
1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 0.6 ml；50%的甘油5 ml；10%的SDS 溶液2 ml；1%的溴酚兰1 ml；
2. 加入去离子水定容至10 ml；
3. 分装；
4. 在4℃可保存数周，-20℃可保存数月之久。
你还可以参考下面这个配方：
2×SDS凝胶加样缓冲液组分（摘自《分子克隆》第三版）
Tris-HCl pH6.8（100 mM）；SDS （4%）；溴酚兰（0.2%）；甘油（20%）；β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（200 mM）
不含硫代试剂的加样Buffer可在室温保存。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇临用前加入。
SDS-PAGE大致流程
1. 将玻片装置搭建起来，加水静置，检查是否有渗漏。
2. 配制分离胶加入2玻片间，加时尽量减少气泡，由玻片一端连续、快速、均匀的注
入，可适当摇晃，使得分离胶上界面尽量水平；加保护液（0.1% SDS）静置凝聚。
加保护液时，头应均匀扫过玻片上沿，切不可由一端注入。
3. 配制浓缩胶待分离胶凝固后，去除保护液，依同样方法加入上层浓缩胶，并插入梳
齿模具，静置。插入模具后，加少许浓缩胶，补平液面。
4. 配制电泳缓冲液，浓缩胶凝固后，玻片取下，放入电泳槽中，有凹陷玻片朝向内侧，
并将玻片用夹子夹紧，在外侧玻片粘上凹槽指示薄片，取下梳齿，加入电泳缓冲液，
平板内侧液面以刚没过凹槽上沿为宜。
5. 样品处理将待分析样品配制成合适的浓度或浓度梯度溶液，连同marker分装于Ep管
中，并加入loading buffer ，100℃煮沸。此步可调至步骤3后做，一般4完成后不宜等
待过长时间，最好立即加样、通电。
6. 将样品液依次加入梳齿形胶孔中，每孔上样量10ul。
7. 接通电源，设为恒流10 mA，待样品跑至分离胶界面后，调整电流为15 mA。
8. 胶跑完后，固定（0.5h~）、染（1.5h~）、脱。
固定液：40%乙醇+10%乙酸+纯水（室温）
脱液：25%乙醇+8%乙酸+纯水（室温）
考染液：0.02% 考马斯亮蓝原液（原液配制—100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%(w/v) 磷酸）将原液用乙醇：乙酸：水=3：1：6的溶液稀释10倍，即可用于胶片染。
注意：
高见光1. 玻璃板一定要清洗干净，否则在染时会有不必要的凝胶背景。
2. 过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度
的过硫酸铵溶液只能当天使用。
3. 分装的TEMED须用锡箔纸包裹避光保存于4℃冰箱内。
4. SDS溶液切不可放入冰箱，会产生沉淀。
今欲配制100 mL的1 mol/L的稀盐酸，算法如下：
所需的HCl的物质的量 = 0.1 L * 1 mol/L = 0.1 mol。
所以需要的浓盐酸的量 = 0.1 mol/ 12 mol/L= 0.008333 L = 8.33 mL.加水至100ml。
33.4ml浓盐酸加水至100ml，即4mol/L盐酸。
常见问题及分析
⒈ 配胶缓冲液系统对电泳的影响？
在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。
⒉ 样品如何处理？
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的
分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
⒊ SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED 四甲基乙二胺，催凝剂，加速AP 催化作用；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
⒋ 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染三种染料，不同染料又各自不同的染方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
⒌“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
⒍ “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
⒎ 为什么带出现拖尾现象？
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
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