实验六 食品中黄曲霉毒素B1的测定
一、实验目的与要求
学习薄层层析法测定粮食中黄曲霉毒素B1原理及步骤。 二、实验原理
样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。 三、实验仪器与试剂
仪器：玻璃板：5×20cm；涂布器；谱展开槽（25×6×4cm）；紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片；微量注射器：20uL,10uL各一支
试剂：（AR）；正己烷（AR 沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）；甲醇（AR）；苯 （AR）；乙腈（AR）；无水乙醚（AR）；丙酮（AR）。（以上试剂应重蒸，
并应经检验对薄层谱测定无干扰）
苯-乙腈(98:2)混合溶液；甲醇-水（55:45）混合溶液；三氟乙酸（AR）；氯化钠（AR）；无水硫酸钠（AR）；硅胶G（薄层谱用）。 5%次氯酸钠溶液：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀。另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3.10H2O）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作消毒剂。
黄曲霉毒素B1标准贮备液：用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFT B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFT Brbd-3121的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）。
黄曲霉毒素B1标准应用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黄曲霉毒素B1标准应用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黄曲霉毒素B1标准应用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL 0.2ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。
四、操作步骤
1．样品预处理
称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷，将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入第二分液漏斗中。在第二分液漏斗中加入20mL，振摇2分钟，静止分层后，放出层，经盛有约10g先用湿润的无水硫酸钠的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL提取一次，层一并滤入蒸发皿中，最后用少量洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65℃水浴上挥干，
然后放入冰盒上泠却2-3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下，继续溶解、混匀，晶体消失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。
波纹管换热器
2．样品测定
1>薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5×20cm、厚度为0.25 mm的薄层板三块。于空气中干燥约15分钟后，在100℃下活化2小时，取出放入干燥器中保存。
2>点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液： 第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液
第二点：20uL双端面机械密封样液
第三点：20uL 样液 + 10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液
第四点：20uL 样液 + 10uL 0.2ug/mL AFT B1 标液
要求点距边缘和点间距约为1cm,样点直径约3cm,大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。
3>频率补偿电路展开：在展开槽内加10mL无水乙醚，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL 丙酮+（8+92）混合溶剂，展开10-12cm，取出挥干。
4>结果观察：将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察：a.若第一点无荧光或都无荧光。说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备。b.第一点有荧光，而其余三点无荧光。说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。c.第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFT B1或含量小于最低检出量。d.四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。
5>确证实验：于另一薄板上左边依次点二个样：
第一点：10uL0.04ug/mL AFT B1标液
第二点：20uL样液
在以上两点各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40℃。
再于薄层板的右边点以下二个点：
第三点：10uL 0.04ug/L AFT B1 程控电压衰减器标液
第四点：20uL样液
同第3>步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFT B1标准点相同的衍生物AFT B2a ,未加TFA的第三、四点作空白对照。
6>稀释定量：若第二点的荧光强度比第一点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一薄板上点四个点：
第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B1标液
第二点：10uL 样液
第三点：15uL 样液
第四点：20uL 样液
展开后取荧光强度与第一点相同的样点进行计算。
五、数据记录与结果计算
样品中黄曲霉毒素B1的含量按下式计算：
V1 × D
X = 0.0004 × ————
V2 × m
式中：X ——样品中AFT B1 的含量，ug/kg (ppb)；V1——稀释前样液的总体积，mL；V2——出现同等荧光强度的稀释后样液点样量，uL；D ——样液的稀释倍数。
六、注意事项
1. 样品采集与处理: 粮油食品中的AFT分布极不均匀，尤其是玉米，稻谷等颗粒样品，为了
得到可靠的分析结果，必须在样品扦取、制备过程中充分保证样品的代表性。
2. 提取与净化: 根据相似相溶原理，用石油醚-甲醇水系统振荡提取，AFTB1及醇溶性素溶解在甲醇水相中，而绝大部分油脂和素则进入石油醚相中被分离开来。
3. 反萃取: 将加到甲醇水中，通过液液萃取法使AFT进入层，而试样中的醇溶性杂质、素等干扰物质则留在甲醇溶液中。这样做目的有两个：一是进一步净化提取；二是甲醇水沸点高，不易浓缩，也不能点板，故要萃取到中。
4. 脱水过滤: 萃取液中会含有少量水分，如不予处理，在下一步65℃水浴浓缩过程中，水分还会留在蒸发皿上。所以标准中用盛装有无水Na2SO4 的慢速定量滤纸脱水过滤，注意过滤速度一定要慢。
闪蒸罐5. 定容: 定容操作一定要小心迅速，以免苯-乙腈溶液挥发致使体积减少从而导致浓度发生变化而影响结果的准确性。
6. 薄层板准备: 薄层板使用前须在105-110℃下活化1h，保存在干燥
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