广东化工2019年第16期·4·
www.gdchem 第46卷总第402期
邹冬璇，刘姗姗，柯伟豪，张盖堂，王燕*
(华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237)
Separation and Analysis of Thiols by HPLC-UV with Pre-column Derivatization
Zou Dongxuan,Liu Shanshan,Ke Weihao,Zhang Gaitang,Wang Yan *
煤气化制氢(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)
Abstract:Cysteine (Cys),homocysteine (Hcy)and glutathione (GSH)were separated and analyzed by HPLC-UV using pre-column derivatization with the reported probe MNP as the derivatization reagent.The results showed that Cys and GSH could be separated well with the retention times of their derivatized products being 5.9min and 7.1min,respectively.However,only partial separation were obtained between the derivatives of Cys and Hcy because of their similar structures.Good linear relationship between the peak area and GSH/Cys concentration were found in the range of 1~30µM/1~20µM.The detection limit of GSH/Cys was calculated to be about 20nM.
Keywords:Pre-column Dericatization ；High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)；Cysteine (Cys)；Homocysteine (Hcy)；Glutathione (GSH)
1
引言
硫醇作为生物体内大量蛋白质和生物小分子的重要组成部分广泛地存在于生命体中并发挥重要作用。硫醇在生命体内以非蛋白硫醇、蛋白硫醇及二硫化物这三种主要形式存在。其中，生物系统中的非蛋白硫醇，如半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)结构相似，但对生物体赋予了不同而又重要的生理功能。大量文献表明，通过对正常人和患者体内的三种硫醇浓度的检测可以看出三种
硫醇的不同浓度代表着机体内部反应是否正常[1]。因此，硫醇的分离分析在医学和生命科学中的具有重要意义。
硫醇化合物的极性较强，极易氧化，难储存，且在紫外光区无强吸收、亦不具有荧光特性。目前检测硫醇的方法主要有比法、高效液相谱法(HPLC)、电化学分析法、紫外吸收法和荧光分析法等[2-4]。本研究在实验室前期合成的新型荧光探针MNP 的基础上[5]，对Cys 、Hcy 和GSH 进行柱前衍生化处理，并利用HPLC-UV 法对三种硫醇衍生物进行分离分析。
2实验部分
2.1实验原理黑发液
为了实现对硫醇的快速检测，在本实验室的前期工作中，设计合成了以萘酰亚胺为荧光团，马来酰亚胺为硫醇受体的荧光探针MNP 。该探针水溶性好，在pH=7.4的PBS 溶液中，MNP 与硫醇反应速度快，1min 内反应完全，并且产物有强烈的紫外吸收，反应机理如图1所示。但是，该探针对大多数含巯基化合物(硫醇、含自由巯基蛋白质)均有响应，选择性低，限制了对实际样品中硫醇的区分检测。考虑到高效液相谱具有以下优点：(1)可以实现对混合试样的分离检测；(2)样品用量少；(3)利用高效液相谱-紫外检测法(HPLC-UV)比仅用紫外检测器对分析物的检出限更低、灵敏度更高，且探针MNP 具备良好的衍生化试剂的条件。因此，我们以探针MNP 作为衍生化试剂，利用HPLC-UV 法来
分离分析小分子硫醇。
图1探针MNP 与硫醇反应机理示意图
Fig.1Proposed reaction mechanism of MNP with thiols
2.2试剂与仪器
仪器：Agilent 1260VL 高效液相谱仪，紫外检测器。
试剂：磷酸二氢钠(AR)，上海凌峰化学试剂公司；磷酸氢二钠(AR)，上海凌峰化学试剂有限公司；乙腈(谱纯)，霍尼韦尔公司；谷胱甘肽(AR)，Sigma-Aldrich 公司；半胱氨酸(AR)，Sigma-Aldrich 公司；同型半胱氨酸(AR)，Sigma-Aldrich 公司。2.3溶液配制
准确配制3×10-2M 的探针MNP 乙腈储备液。准确称取一定量的Cys 、Hcy 和GSH 溶于PBS 中制得30mM 的储备液。2.4硫醇标准样的衍生方法
向3mL 的PBS 的离心管中依次加入20µL 的探针储备液，0~40µL 的硫醇(Cys 、Hcy 和GSH))储备溶液，得到一系列相应浓度的硫醇反应液，于25℃下反应5min ，用于浓度滴定实验。向3mL 的PBS 溶液中加入40µL 的探针储备液和40µL 的GSH 、Hcy 储备液，于25℃下反应5min ，用于回收率测定。2.5谱条件
谱柱Sinopak C18反相谱柱(4.6mm×150mm)；紫外检测波长：405nm ；柱温：25℃；流速：1mL/min ；进样量20µL ；以超纯水和乙腈溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱分离，根据衍生化反应产物的极性调整流动相的梯度洗脱程序，具体分离条件参见各谱图下方说明。
3结果与讨论
3.1HPLC 衍生化法重复性考察
衍生化方法的稳定性是确保定量分析结果可靠性的前提。以浓度为400µM 的GSH 标准样品作为分析样品，在控制衍生化反应条件及谱分离条件一致的情况下平行展开4次实验，以考察实验结果的重现性。表1罗列了实验所得的保留时间和谱峰面积，经过计算，保留时间的相对偏差小于0.26%，谱峰面积的相对标准偏差小于0.20%，实验重复性良好。
表1平行实验重复性考察
Tab.1The reproducibilty of the parallel experiments Condition:1-11min 5-95%B,12-14min 95-5%B
编号保留时间/min
峰面积1 5.959249.52 5.936248.33 5.978249.14
5.942
248.9
钍燃料[收稿日期]2019-06-21
[作者简介]
邹冬璇(1988-)，女，泰州人，工程师，主要研究方向荧光探针。*为通讯作者：王燕(1961-)，女，上海人，副教授，研究方向分析化学。
2019年第16期广东化工
第
46卷
总第402期www.gdchem·5·3.2三种硫醇衍生产物的谱分离条件优化
我们对三种硫醇衍生化产物的谱分离条件进行优化。首先
人脸抓拍系统选用的洗脱剂条件为：流动相A：水，B：乙腈；梯度洗脱：2-12
min5-95%B，16-18min95-5%B；等度洗脱：0-2min5%B，
12-16min95%B，18-20min5%B，分别对三种硫醇的产物进行
检测，见图2。从图上可以看出，由于GSH衍生化产物的极性与
Hcy和Cys的极性差别较大，很容易将GSH衍生化产物与Hcy
和Cys的产物分开，但是Cys和Hcy的结构非常相似，后者仅比
前者多了一个甲基，因此我们通过调整梯度洗脱程序尽量实现
Cys和Hcy衍生化产物的分离，如图3所示。随着梯度洗脱时间
的增加，Cys和Hcy衍生化产物的保留时间增加，其分离效果也
得到改善。我们选择图3d的分离条件对三种硫醇产物进行分离。
由图4可知，GSH的加入并不影响Hcy和Cys衍生化产物的分离，
且在该谱条件下对将GSH衍生化产物与Hcy和Cys衍生化产
物完全分开。其中峰a为GSH衍生化的峰，峰b和峰c为Cys、
Hcy的衍生峰。
Inject volume=20µL,separation condition：0-2min5%ACN;2-12min5-95%番茄采摘机
ACN;12-16min95%;16-18min95-5%ACN;18-20min5%ACN;25℃
图2MNP与三种硫醇衍生化产物的HPLC-UV谱图
Fig.2HPLC-UV chromatogram of MNP labled three thiols
Separation condition：(a)0-1min15%ACN;1-15min15-75%ACN;15-16min95%;16-17min95-5%ACN;17-18min 5%ACN;(b)0-1min5%ACN;1-20 min5-75%ACN;20-22min75%;22-24min75-5%ACN;24-26min5%ACN;(c)0-1min5%ACN;1-60min5-75%ACN;60-62min75%;62-64min75-5% AC
N;64-66min5%ACN;(d)0-1min15%ACN;1-60min15-75%ACN;60-62min75%;62-64min75-15%ACN;64-66min15%ACN;25℃
图3MNP与Hcy和Cys衍生化产物的HPLC-UV谱图
Fig.3HPLC-UV chromatogram of MNP labled Hcy and Cys
Peak a-MNP labled GSH,Peak b-MNP labled Hcy,Peak c-MNP labled Cys
Separation condition：0-1min15%ACN;1-60min15-75%ACN;60-62min
75%;62-64min75-15%ACN;64-66min15%ACN;25℃.
图4MNP与三个硫醇(GSH,Hcy,Cys)衍生化反应产物的
HPLC-UV谱图
Fig.4HPLC-UV chromatogram of MNP labeled three thiols
3.3衍生化法对GSH和Cys的定量
Peak a-MNP labled GSH,Peak b-MNP labledCys
Separation condition:0-1min5%CAN;1-11min5-95%CAN;11-12min
95%;11-14min95-5%CAN;14-15min5%ACN;25℃.
图5MNP与GSH和Cys衍生化反应产物的HPLC-UV谱图
Fig.5HPLC-UV chromatogram of MNP labeled GSH and Cys
从上述实验结果可知，由于Cys和Hcy的结构非常相似，不
能实现对Cys和Hcy衍生化产物的完全分离。因此，我们进一步
广东化工2019年第16期·
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对GSH 和Cys 进行分离分析，从谱图5可以看出，两个峰实现了完全的分离。GSH 衍生化的峰为峰a(t =5.9min)，Cys 衍生产物的峰为峰b(t =7.1min)。根据谱峰a 的峰面积与GSH 浓度关系曲线可知：当反应液中GSH 介于1~30µM 范围内时，两者呈现良好的线性关系(图6a)，线性回归方程为y =2.
563+7.305x ，相关系数R 为0.9975。同样我们也做了对Cys 的浓度滴定曲线，当反应液中Cys 介于1~20µM 范围内时，谱峰b 的峰面积与Cys 浓度呈现良好的线性关系(图6b)，线性回归方程为y =-0.3104+12.67x ，相关系数R 为0.9990，以上结果表明MNP 可用于分离分析GSH 和Cys ，并且实现了对GSH 和Cys 的定量检测，检出限分别为2.3×10-8mol/L 和1.8×10-8mol/L ，为实际样品的检测奠定了基础。
废渣4
图6MNP 与GSH(a)和Cys(b)衍生化反应的标准曲线
Fig.6The standard curves of the derivatized reaction of MNP with GSH (a)and Cys (b)
3.4回收率测定
为了探讨MNP 作为衍生化试剂在检测复杂样品中硫醇(GSH 和Cys)的可行性。我们将GSH 和Cys 两种硫醇的标准样混合加入到3mL 20.0µmol/L MNP 的PBS 溶液中，利用HPLC-UV 法分
别检测GSH 和Cys 的含量，并且计算混合试样中GSH 和Cys 的
回收率分别为90.0%和85.0%(表2)。上述结果进一步表明MNP 可作为衍生化试剂应用于对实际试样中GSH 和Cys 的定量检测。
表2混合试样中GSH 和Cys 的含量测定
Tab.2Determination of GSH and Cys in mixed sample
加入量/(µmol/L)
衍生化产物峰面积
测量值/(µmol/L)
回收率%GSH 10.068.39.0090.0Cys
10.0
107.4
8.50
85.0
4总结
本研究以硫醇探针MNP 作为衍生化试剂对三种硫醇进行衍生化处理，利用HPLC-UV 法对三种硫醇衍生物进行分离检测。通过梯度洗脱(0-1min 5%CAN ；1-11min 5-95%CAN ；11-12min 95%；12-14min 95-5%CAN ；14-15min 5%ACN)实现了对GSH 和Cys 衍生产物的分离分析。两者线性范围分别为1~30µM 和1~20µM ，检出限分别为2.3×10-8mol/L 和1.8×10-8mol/L ；对混合试样中GSH 和Cys 分离、检测的加标回收率分别是90.0%和85.0%。该结果为实际生物样品中硫醇的检测奠定了基础。
参考文献
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[3]明永飞，孙玉希，石运伟，等．新型荧光衍生试剂用于氨基酸的毛细管电泳分离[J]．曲阜师范大学学报：自然科学版，2004，30(2)：65-68．[4]刘翻，孙元社，唐涛，等．新型激光诱导荧光检测器的研制及评价[J]．现代仪器，2008，14(6)：55-57．[5]Song L ，Sun X D ，Ge Y ，et al ．Anaphthalimide-based fluorescent probe for mercapto-containing compounds ．Chinese Chemical Letters 2016，27(12)：1776-1780．
(本文文献格式：邹冬璇，刘姗姗，柯伟豪，等．柱前衍生化HPLC-UV 法对硫醇的分离分析[J]．广东化工，2019，46(16)：4-6)
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