慢性心肌缺血除导致急性冠脉综合征外，可继发缺血性心肌病（IHD ），引起心肌细胞凋亡、坏死，心肌纤维 化重构，严重损害心脏功能，甚至导致死亡［1-2］
。此外，心
肌缺血可继发多种心律失常，以心房颤动(AF ）最多见［3］
。AF 可诱发卒中和体循环动脉栓塞，研究表明AF 患者缺
血性卒中风险是非AF 患者的4~5倍［4］。心肌缺血继发
AF 的具体机制尚不清楚，大量证据提示缺血引起的心
肌细胞凋亡在其中扮演重要角［5］
。然而，目前针对细胞凋亡的干预措施效果并不理想，亟待开发新的靶点。
近年来，RNA 在人体生理、病理过程中的重要作用被不断揭示［6,7］。研究发现，敲低长链非编码RNA-ZFAS1可以抑制心梗大鼠心肌细胞凋亡［8］。mRNA 降解与线粒体损伤密切相关，是促使细胞凋 亡发生的重要病理基础［9］。广泛的mRNA 降解是细胞凋亡早期的标志性特征，它的出现甚至早于膜脂质紊乱、DNA 断裂及
翻译起始因子失活［9］
。有研究表明，许多编码功能蛋白
Role of PNPT1in cardiomyocyte apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation
ZHANG Xinqin 1,2,WANG Xiong 2,LI Qin 3,CHEN Yingmei 2,ZHANG Xinyan 4,WANG Peng 2,YUAN Mu 5,PEI Haifeng 1,2
1
College of Medicine,Southwest Jiaotong University,Chengdu 611756,China;2Department of Cardiology,3Second Ward of Cadres,4Medical Information Data Office,5Medical Center,General Hospital of Western Theater Command,Chengdu 610083,China
摘要：目的探讨多核糖核苷酸核苷转移酶1(PNPT1)对氧糖剥夺（OGD ）诱导心房肌细胞凋亡的影响和作用机制。方法体外 无纺布折叠机
培养HL-1心房肌细胞，PNPT1-siRNA 转染HL-1细胞。实验分组为：正常组（Control ）、OGD 组、NC-siRNA 组（转染乱码RNA ）、PNPT1-siRNA 组、OGD+NC-siRNA 组和OGD+PNPT1-siRNA 组。通过CCK-8检测细胞存活率，qPCR 检测ACTB mRNA 和TUBA mRNA 的含量，Western blot 检测PNPT1蛋白水平，流式细胞术检测HL-1细胞凋亡率，JC-1试剂盒检测线粒体膜电位，透射电镜观察线粒体形态。结果随OGD 诱导时间延长，HL-1细胞质中PNPT1的蛋白表达水平呈上升趋势（P <0.05）。与NC-siRNA 相比，PNPT1-siRNA 明显减少细胞内PNPT1表达。OGD 条件下，ACTB mRNA 和TUBA mRNA 降解增加（P <0.05），HL-1心房肌细胞凋亡率增加（P <0.05）；相反地，PNPT1-siRNA 则抑制ACTB mRNA 和TUBA mRNA 降解（P <0.05），同时降低HL-1心房肌细胞凋亡率（P <0.05），并且改善线粒体膜电位以及线粒体形态。结论抑制PNPT1可改善线粒体损伤并减少凋亡相关mRNA 的降解，从而减轻OGD 诱导的HL-1心房肌细胞凋亡损伤。关键词：心肌细胞凋亡；氧糖剥夺；多核糖核苷酸核苷转移酶1；凋亡相关mRNA 降解
Abstract:Objective To explore the effect of inhibiting polyribonucleotide nucleotidyl-transferase 1(PNPT1)on oxygen-glucose deprivation (OGD)-induced apoptosis of mouse atrial myocytes.Methods Cultured mouse atrial myocytes (HL-1cells)with or without OGD were transfected with PNPT1-siRNA or a negative control siRNA (NC-siRNA group),and the cell survival rate was detected using CCK-8assay.The expression levels of ACTB and TUBA mRNA were detected with qP
CR,and the protein expression of PNPT1was detected with Western blotting.The apoptosis rate of the treated cells was determined with flow cytometry,the mitochondrial membrane potential was detected using JC-1kit,and the mitochondrial morphology was observed using transmission electron microscope.Results With the extension of OGD time,the protein expression levels of PNPT1increased progressively in the cytoplasm of HL-1cells (P <0.05).Transfection with PNPT1-siRNA significantly reduced PNPT1expression in HL-1cells (P <0.05).Exposure to OGD significantly enhanced degradation of ACTB and TUBA mRNA (P <0.05)and markedly increased the apoptosis rate of HL-1cells (P <0.05),and these changes were significantly inhibited by transfection with PNPT1-siRNA (P <0.05),which obviously increased mitochondrial membrane potential and improved mitochondrial morphology of HL-1cells exposed to OGD.Conclusion Inhibition of PNPT1improves mitochondrial damage and reduces degradation of apoptotic-associated mRNAs to alleviate OGD-induced apoptosis of mouse atrial myocyte.
Keywords:myocardial cell apoptosis;oxygen-glucose deprivation;polyribonucleotide nucleotidyl-transferase 1;apoptosis-related mRNA degradation
多核糖核苷酸核苷转移酶1在氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡损伤中的作中的作用用
张信琴1，2，汪雄2，李琴3，陈颖梅2，张新颜4，王鹏2，袁木5，裴海峰1，21西南交通大学医学院，四川成都611756；西部战区总医院2心内科，3干部病房二科，4医学信息数据室，5卫勤中心，四川成都610083
收稿日期：2021-11-12
基金项目：国家自然科学基金（81970241）；西部战区总医院院管重点项目（2021-XZYG-A03）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81970241).作者简介：张信琴，硕士，E-mail:****************通信作者：裴海峰，博士，教授，E-mail:*******************doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.04.15J South Med Univ,2022,42(4):584-590
·
·584
的mRNA在凋亡的非洲爪蛙卵中明显降解，以管家基因最为显著［10］，更有学者在植物和酵母菌发生凋亡时发现了rRNA和mRNA的裂解［11,12］。此外，通过CD95等死亡受体诱导小鼠胸腺细胞凋亡后，细胞内包括管家基因在内的大量mRNA发生了降解［13］。但截至目前，凋亡相关mRNA的降解是否影响心肌细胞的凋亡尚不清楚。
多核糖核苷酸核苷转移酶1（PNPT1)是一种高度进化的保守基因，其编码的PNPT1蛋白主要定位于线粒体膜间隙内［14,15］。功能学研究发现，在HCT116细胞中线粒体内的PNPT1主要发挥RNA转运功能，而泄露至细胞质后其核酸外切酶活性可诱发mRNA降解，引起细胞凋亡［16］。但是该蛋白对凋亡相关mRNA的调控在缺血性心肌病中是否发挥作用尚未见报道。
本研究通过敲低HL-1心肌细胞的PNPT1基因，以氧糖剥夺（OGD）模拟体内心肌缺血损伤环境，进而探讨抑制PNPT1对OGD诱导的HL-1心肌细胞凋亡的影响及作用机制，以期为IHD的抗细胞凋亡策略提供新的干预靶点。
1材料和方法
1.1细胞
HL-1细胞（小鼠心房肌细胞）（武汉普诺赛生命科技有限公司）。
1.2主要试剂
MEM培养基（Procell）；胎牛血清（Gibco）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒及SYBR(TaKaRa)；qPCR引物由成都擎科伟业生物科技有限公司合成；PNPT1抗体（Proteintech）；PNPT1 siRNA三条序列和对照序列由成都擎科伟业生物科技有限公司合成；脂质体
Lipofectamine2000(Invitrogen)；ɑ-Tubulin抗体（Affinity）；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（Solarbio）；JC-1试剂盒（Solarbio）；山羊抗兔II抗（Solarbio）；ECL发光液（Millipore）。
1.3主要方法
1.3.1HL-1细胞培养小鼠HL-1细胞的培养基成分：10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的MEM培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中孵育。随后每2d更换培养液，待细胞生长融合至约90%时，用0.25%胰酶消化后按照1∶3传代培养。选择对数生长期的细胞进行实验。
1.3.2OGD实验模型建立根据参考文献［5］的方法，将对数生长期的HL-1细胞接种于60mm培养皿中，于第2天将已贴壁细胞更换为无糖无血清培养基并置于缺氧培养箱中（1%O2、94%N2、5%CO2、37℃），按照实验需求培养不同时间后用于随后的实验。实验进行如下分组：正常组（Control）、氧糖剥夺组（OGD）、NC-siRNA 组（转染乱码RNA）、PNPT1-siRNA组、OGD+NC-siRNA组和OGD+PNPT1-siRNA组。
1.3.3CCK-8检测细胞存活率取对数生长期细胞，按6×103/孔细胞接种于96孔板，过夜贴壁后，对照组置于5%CO2细胞培养箱中正常培养，实验组经不同OGD时间处理后，各组细胞按CCK-8试剂盒说明书，加入CCK-8反应液，于37℃孵箱中孵育1h，酶标仪450nm 波长检测吸光度值A450nm。
1.3.4细胞PNPT1siRNA转染将细胞悬液置于孔板中，细胞生长至约40%密度时，按照试剂使用说明用Lipofectamine2000作为转染试剂以50nmol/L浓度进行PNPT1siRNA转染或对照载体转染，每组设置3个复孔。
1.3.5qPCR检测ACTB mRNA、TUBA mRNA水平按照RNA提取试剂盒说明书提取HL-1细胞的总RNA。标准化各组RNA浓度，反转录为cDNA后进行扩增，以7SL为内参照，用2-ΔΔCt法计算ACTB mRNA以及TUBA mRNA的相对表达量。ACTB的上游引物序列为：5'-AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT-3'，下游引物序列为：5'-ACA GCC TGG ATA GCA ACG TAC A-3'；TUBA的上游引物为：5'-TCT GTG AAA CTG GTG CTG GA-3'；下游引物序列为：5'-AGT GAC CAC GGG CAT AGT TGT T-3'；7SL的上游引物序列为：5'-ATC GGGTGT CCG CAC TAA GTT-3'，下游引物序列为：5'-CAG CAC GGG AGT TTT GAC CT-3'。
1.3.6Western blot检测细胞PNPT1的表达按照蛋白提取说明书提取HL-1细胞蛋白，用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度。按20μg总蛋白量上样，SDS-PAGE 分离蛋白，转印至PVDF膜，5%BSA中室温封闭1.5h。加入相应的I抗（PNPT1按1∶2000稀释），4℃摇床孵育过夜。次日回收I抗，TBST洗膜3次，10min/次，加入II 抗（1∶5000）室温孵育1h。再次TBST洗膜，与ECL发光液充分反应后扫描显影。Image J软件分析结果。1.3.7流式细胞术检测细胞凋亡率将HL-1细胞按1×105/孔接种于6孔板中，贴壁后更换为无双抗培养液，同时加入PNPT1-siRNA1或NC-siRNA处理24h后再OGD 处理16h，
收集上清，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗涤3次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒说明书进行染，在1h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。Flow Jo软件分析结果。
1.3.8JC-1检测线粒体膜电位将各组细胞用胰酶消化，PBS重悬，2000r/min下离心5min，重悬于500µL 细胞培养液中；按照JC-1线粒体膜电位水平检测试剂盒说明书，制备反应缓冲液备用，吸取500µL的JC-1工作液将细胞均匀悬浮，置于培养箱内20min，取出细胞，2000r/min离心5min，加入稀释好的反应缓冲液洗涤2
www.j-smu J South Med Univ,2022,42(4):584-590·
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次，再用500µL JC-1染缓冲液（1×）重悬细胞，用流式细胞仪分析结果。
1.3.9透射电镜观察线粒体形态0.25%胰酶消化收集各实验组细胞，PBS 液冲洗2次，之后向细胞内加入3%戊二醛，固定1h ，PBS 液冲洗2次，再向细胞内添加1%锇酸固定1h ，丙酮酸梯度脱水；包埋，超薄切片，铀铅双染；透射电子显微镜拍片。1.4统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，
P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1OGD 诱导HL-1心肌细胞凋亡损伤
给予HL-1心肌细胞不同时间梯度OGD 诱导后，利用CCK-8检测细胞存活率。结果显示，随着OGD 诱导时间延长，HL-1心肌细胞存活率呈下降趋势（图1A ，P <0.05），OGD 诱导16h 心肌细胞存活率最低。在16h 诱导节点检测心肌细胞凋亡率显示细胞发生明显凋亡（图1B ，P <0.05）。
2.2OGD 诱导增加HL-1心肌细胞胞质PNPT1含量
Western blot 结果显示，随着OGD 诱导时间延长，HL-1心肌细胞胞质中PNPT1的蛋白水平呈上升趋势，且在诱导16h 节点PNPT1蛋白水平最高，这与OGD 诱导HL-1心肌细胞凋亡的趋势一致（图2，P <0.05）。2.3PNPT1敲低减轻OGD 诱导的HL-1心肌细胞凋亡
引入siRNA 在OGD 条件下敲减PNPT1表达，敲减效率验证试验结果显示PNPT1-siRNA1效率最高（图3A ，P <0.05），且siRNA 敲减可以有效降低胞质PNPT1蛋白含量。敲减PNPT1后，利用流式细胞术检测HL-1心肌细胞OGD 诱导下的凋亡情况，结果显示，未予以OGD 诱导时PNPT1敲减未明显影响HL-1心肌细胞凋亡，而予以OGD 诱导后PNPT1敲减明显降低了细胞凋亡水平（图3B ，P <0.05）。
2.4PNPT1敲低减少OGD 条件下凋亡相关mRNA 降解
qPCR 结果显示，OGD 诱导引起了ACTB 和TUBA mRNA 的降解（图4A 、C ，P <0.05）。利用siRNA 敲减PNPT1表达后发现与NC-siRNA+OGD 组相比，siRNA1+OGD 组ACTB 和TUBA mRNA 降解被抑制（图4B 、D ，P <0.05）。
2.5PNPT1敲低减轻HL-1心肌细胞OGD 下线粒体损伤
利用JC-1检测线粒体膜电位，结果显示OGD 可诱导线粒体膜电位下降，而敲减PNPT1后OGD 诱导的线粒体膜电位下降得到部分逆转（图5A ，P <0.05）。透射电镜结果显示，OGD 诱导后线粒体形态发生明显变化，整体呈肿胀状态，内部电子密度降低，嵴消失，形成空泡结构；PNPT1敲减后线粒体形态得到明显改善，整体肿胀程度降低，内部可见完整的嵴结构（图5B ）。
图1OGD 诱导心肌细胞凋亡损伤
Fig.1OGD induces apoptosis of cultured mouse cardiomyocytes (HL-1cells).A :CCK-8assay for detecting cell survival rate.B :Flow cytometry for detecting cell apoptosis rate.*P <0.05vs 0h,#P <0.05vs control (n =6).
04
812
16
OGD (h)
C e l l v i a b i l i t y (%)
150
10050
*
*
*
*
Control OGD
R a t e o f a p o p t o s i s (%)
50403020100
#
A
B
OGD
高压锅限压阀Control J South Med Univ,2022,42(4):584-590www.j-smu
·
·586
3讨论
在动脉粥样硬化斑块等病理因素作用下，IHD 患者心脏冠状动脉血流被限制，心肌处于慢性缺血条件下，导致心肌细胞凋亡，纤维组织增生，引起心肌重构，心脏
功能降低和心律失常，甚至诱发死亡［17-19］
。研究发现，急性
心肌梗死后梗死周围的区域有显著的心肌细胞凋亡［20］
，而且患者在急性心肌梗死后出现症状性心力衰竭与细
胞凋亡率显著增加相关［21］。因此，抑制心肌细胞凋亡，减少细胞数量损失被认为是预防IHD 患者心脏损伤的重要策略，靶向mRNA 凋亡相关疾病及心血管疾病也是目前的研究热点［22,23］。本研究聚焦于mRNA 降解介导心肌细胞凋亡的新视角，基于OGD 诱导HL-1心
图2不同氧糖剥夺（OGD ）时间处理后HL-1细胞PNPT1的蛋白表达
Fig.2Protein expression of PNPT1in HL-1cells exposed to different OGD time.*P <0.05vs 0h (n
=6).
PNPT1α-tubulin OGD
0h
4h
8h
12h
16h
0481216
OGD (h)
1.5
1.0
0.5
P N P T 1/α-t u b u l i n
*
*
*
图3敲减PNPT1减轻OGD 诱导的HL-1细胞凋亡
Fig.3Knockdown of PNPT1reduces OGD-induced apoptosis of HL-1
cells.A :PNPT1protein expression detected by Western blotting.B :Flow cytometry for detecting cell apoptosis rate.*P <0.05(n =6).
R a t e o f a p o p t o s i s (%)
0.60.4
0.2
P N
P T 1-s i R N A
1+O G D N C -s i R N A +O G D P N P T 1-s i
R N A 1N C -s i R N A *
*
*
B
PNPT1α-tubulin
P
N P
T 1-s i R
N A 3
P
N P
T 1-s i R
N A 2P
N P
T 1
-s i R
硬质合金模具N A 1N C
-s i R N A
P N P T 1/α-t u b u l i n
水力分级机1.5
1.0
0.5
P N
P T 1-s i R N A 3P N P T 1-s i R N A 2P N P T 1-s i R N A 1N C -s i R N A *
*
*
A
NC-siRNA
PNPT1-siRNA1
NC-siRNA+OGD61850 mms
PNPT1-siRNA1+OGD
www.j-smu J South Med Univ,2022,42(4):584-590
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·587
图4敲减PNPT1抑制HL-1细胞OGD 条件下凋亡相关mRNA 的降解
Fig.4Knockdown of PNPT1inhibits degradation of apoptosis-related mRNA in HL-1cells with
OGD.A ,B:qPCR for detecting the relative expression level of ACTB mRNA.C ,D :qPCR for detecting relative expression level of TUBA mRNA.n =6.*P <0.05vs control,#P <0.05v s NC-siRNA,$P <0.05vs NC-siRNA+OGD (n =6).
1.5
1.0
0.5
A C T
B m R N A f o l d c h a n g e (n o r m a l i z e d t o 7S L )
Control OGD
*
1.5
1.0
0.5
T U B A m R N A f o l d c h a n g e (n o r m a l i z e d t o 7S L )
Control OGD
*
A
B
C
D
1.51.0
0.5
A C T
B m R N A f o l d c h a n g e (n o r m a l i z e d t o 7S L )
P N
P T 1-s i R N A 1+O G D N C -s i R N A +O G D
s i R N A 1N C
-s i R N A #
$
T U B A m R N A f o l d c h a n g e (n o r m a l i z e d t o 7S L )
#
硅胶气囊
$
1.5
1.0
0.5
P N
P T 1-s i R N A 1+O G D N C -s i R N A +O G D
P N P T 1-s i R N A 1N C -s i R N A 图5敲减PNPT1减轻OGD 条件下线粒体损伤
Fig.5Knockdown of PNPT1reduces mitochondrial damage in HL-1cells exposed to OGD.A :Flow cytometry for detecting mitochondrial membrane potential (JC-1).B :Transmission electron microscopy for observing morphology of cell mitochondria.*P <0.05vs NC-siRNA+OGD (n =6).
M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l
1.51.00.50
P N
P T 1-s i R N A 1+O G D N C -s i R N A +O G D
O G D *
OGD NC-siRNA+OGD PNPT1-siRNA1+OGD
J C -1R e d
JC-1
Green
A
B
OGD NC-siRNA+OGD PNPT1-siRNA1+OGD
J South Med Univ,2022,42(4):584-590
www.j-smu
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