3.2.5 与酶活测定相关的储备液及缓冲液
PCbuffer：50mM phosphate,12mM citratepH7.0
DNS试剂的配制：
⑴取20.8g氢氧化钠溶于260ml蒸馏水中。
⑵取6g3，5-二硝基水杨酸加入到⑴中氢氧化钠溶液中，加热溶解并混匀。 ⑶取182g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水中。
⑷取5g重蒸酚和5g无水亚硫酸钠加入到酒石酸钠的水溶液中。
⑸将以上各步骤的溶液混合，定容至1L，置于棕瓶中，暗处放置一周后即可使用。
1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液：取1gCMC-Na溶于PCbuffer（pH7.0）中，定容至100ml。置于4°C保存备用。
1%木聚糖溶液：1g木聚糖加入到100mlPCbuffer（pH7.0）中，置于沸水浴中加热5分钟，将
所得木聚糖悬浊液10,000×g离心5分钟，弃沉淀后得木聚糖溶液4°C保存备用。
1mMpNPC溶液（10ml）：分别称取4.6mgpNPC和1.8mg葡萄糖酸内酯，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）中，混匀后4°C保存备用。
1mMpNPG溶液（10ml）：称取3mgpNPG，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）中，混匀后4°C保存备用。
1mMpNPX溶液（10ml）：称取2.7mgpNPX，溶于10mlPCbuffer（pH7.0）中，混匀后4°C保存备用。
Tris-HCl（50mM，pH9.0）：取0.605gTris溶液适量蒸馏水中，调节pH值至9.0后定容至100ml，4°C保存备用。
3×gelbuffer：3MTris-HCl,0.3%SDS,pH8.5。
染液，脱液，电泳缓冲液配方参考Takara目录。
木聚糖酶活性胶复性buffer：25mMTris-HCl,0.1%TritonX-100pH7.0。木聚糖酶活性胶染
buffer：1%刚果红染液。木聚糖酶活性胶脱buffer：1MNaCl
目的蛋白的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax的测定采用Lineweaver-Burk作图法。将底物用PC buffer 配制成不同的浓度，测定等量的纯酶与不同浓度的底物，在最适温度反应30 min 内形成的还原糖，分别计算出反应速度V。以1/[S]六分量传感器为横坐标、1/V 为纵坐标作图，得到一条直线，其横轴截距为-1/Km虚拟地震台网，纵轴截距为1/Vmax(最大反应速度)，斜率为Km/Vmax，由此求出Km和Vmax。
4.2.8.1 PCR水中氨氮的测定方法 产物的纯化
PCR产物纯化实验步骤参照上海生工PCR产物纯化试剂盒说明书。
⑴ 新鲜培养的E. coli单克隆接种到50 ml经高温高压灭菌的LB培养基中，37°C，250 rpm过
夜培养。
⑵ 取4 ml过夜培养的E. coli菌液接种到400 ml LB培养基中（使用2 L三角瓶），37°C，250 rpm培养至OD600为0.375。
⑶ 将⑵中培养的E. coli菌液分装至预冷的50 ml离心管中，并置于冰上5-10分钟。
⑷ 3750 rpm，4°C离心菌液5分钟。
⑸ 所得菌体沉淀重悬于10 ml预冷的CaCl2 buffer（60mM CaCl2，15%甘油，10 mM PIPES，pH 7.0，0.45 μm滤膜过滤除菌）。 ⑹ 3250 rpm，4°C离心菌液5分钟，所得菌体沉淀重悬于10 ml预冷的CaCl2 buffer。
⑺ 重悬的细胞置于冰上放置30分钟。
⑻ 3250 rpm，4°C离心菌液5分钟。
⑼ 所得菌体沉淀重悬于2 ml预冷的CaCl2 buffer。
⑽ 分装⑼中所得的感受态细胞至预冷的无菌EP管中，每管300 μl，每个反应可使用100 μl。分装后置于-80°C保存备用。
4.2.8.3 目的基因与表达载体的连接
所用表达载体为pEASY-E1。连接反应过程如下：
⑴ 纯化后的PCR产物1 μl(转入BL21时加0.5uL)加入到1 μl pEASY-E1载体溶液中，轻轻混合，室温反应20分钟。
⑵ 加连接产物于50 μl刚刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟。
⑶ 42°C准确热激30秒，立即置于冰上。
⑷ 加入250 μl平衡至室温的未加Amp的LB（或SOC）培养基，200 rpm，37°C培养1小时。
⑸ 4000 rpm离心1分钟，弃部分（100uL）上清后，保留约200 μl，轻轻悬浮菌体，取全部菌液涂板（Amp加三倍）。37°C培养过夜。
4.2.8.4 阳性重组子的筛选与鉴定
挑取单菌落划线于含氨苄青霉素的LB 平板培养基（Amp正常）上，于37°C恒温培养箱培养约16小时后挑取单克隆，置于10 μl无菌水中，涡旋混合，取1 μl混合液于25 μl PCR绗缝加工反应体系中，使用T7 promoter primer 和目的基因的反向引物（或T7 terminator primer和目的基因的正向引物）鉴定含有正向插入目的基因片段的重组子，PCR反应条件同4.2.7。提质粒，保菌。
4.2.8.5 阳性重组子的测序检测
4.2.8.4中筛选到的含有正向插入目的基因片段的重组子送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。测序用引物为T7 promoter primer 和T7 terminator primer。
4.2.9 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
将经测序验证序列正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中（操作步骤同基因克隆相应部分）。挑取单克隆，接种于20mL含有氨苄青霉素的LB培养基（Amp加三倍）中，200rpm，37°C过夜培养。次日保菌，再将经过活化的细胞2mL转接至100 ml（300的三角
瓶）至含有氨苄青霉素（Amp加三倍）的LB培养基中，200 rpm，37°C培养约2h至OD600为0.5时，取出1 ml菌液作为未加入IPTG的对照样品，其余菌液中加入终浓度为0.5、1、1.5 mM的IPTG（浓度为0.5mmol，分别加100、200、300uL），置于16°C恒温摇床中震荡培养（对照不摇菌，只有加IPTG的摇菌），诱导蛋白的表达。为了得到最大量的表达，选取不同的诱导时间（3、5、8h）优化获得最佳的表达条件。诱导结束后离心收集菌体，可立即使用或置于-80°C保存备用。
4.2.10 诱导表达蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
取1 ml菌液，12,000 rpm离心1分钟，去上清，菌体沉淀中加入100μl无菌水重悬菌体，再分别加入10 μl 10% SDS溶液和10 μl β-巯基乙醇（后者可不加），混匀后煮沸5分钟。12,000 rpm离心5分钟，取28μl上清，加入7μl 5×上样缓冲液煮沸3min，进行SDS-PAGE分析。染与脱的详细步骤见蛋白质手册。
4.2.11 表达产物的纯化
4.2.11.1 粗酶液的制备
含有目的蛋白的菌体按1 g一个度导航菌体加入4 ml buffer 0，同时加入蛋白酶抑制剂，溶菌酶（10 mg/ml）, 细胞充分悬浮后采用超声波法破碎细胞。所得细胞破碎液经4 °C、10000×g 离心20 min，所得上清经0.22 μm滤膜过滤后即为粗酶液。
4.2.11.2 目的蛋白的纯化
⑴ Ni-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入总体积为10 ml 的经0.22 μm滤
膜过滤的无菌水,每次加入2 ml。
⑵ 加入总体积10 ml 的buffer0，每次加入2 ml。
⑶ 加入步骤2中所得的粗酶液，并穿透3次。
⑷ 加入buffer0，直至无蛋白被洗脱出来（将一滴洗脱液加入到100 μl考马斯
亮蓝蛋白染液中，染液不变蓝）。
⑸ 依次加入咪唑浓度逐渐升高（5 mM-500 mM）的洗脱buffer，直至无蛋白
被洗脱出来。
⑹ 加入镍柱中总体积10 ml 的buffer 0，每次加入2 ml。
⑺ 加入过滤过的30%乙醇，保存镍柱。
IPTG：配制1 M IPTG，过滤除菌后置于-20 °C冰箱备用。
1mg/ml 溶菌酶：取0.01 g溶菌酶溶于10 ml无菌水中，并用0.22 μm生物打印机滤膜过滤除菌，分装并储存于-20 °C冰箱备用
蛋白酶抑制剂：加入无菌水配制成100×母液备用。
Buffer0：50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0。
500 mM咪唑buffer：50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM咪唑，pH 8.0。
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