浙江师范大学行知学院本科毕业设计(论文)外文翻译
译文：
氟化物对淡水硬骨鱼类，鲤属，鲤鱼肝细胞凋亡及Bcl-2，Bax视频显示器
蛋白表达的影响 Chemosphere 91 (2013) 1203-1212
摘要：鱼类直接从水中摄取氟化物，是直接受到水生生态系统氟化物污染影响的生物。此文旨在评估长期暴露在氟化物污染的水域中的鲤鱼，其肝脏组织的氧化应激，病理学变化，细胞凋亡和Bcl-2，Bax表达。结果表明，在90天的氟化物暴露实验后，肝脏组织中SOD的抑制，GSH的活力和MDA的依赖性刺激水平表明了，氟化物引起了鱼体内的氧化应激反应。显微镜检查发现，氟化物对肝脏组织和肝脏组织细胞器的损害与其暴露浓度呈正比；细胞凋亡指数与肝脏含氟量呈显著正相关；水中氟化物的含量与Bcl-2表达，Bcl-2/Bax呈负相关与Bax的表达呈正相关。我们的研究表明，鲤鱼可以承受相当高水平的氟化物暴露，但是90天后氟化物的副作用会出现在鱼类的肝脏中。在氟致病变肝脏过程中，肝细胞凋亡起了重要的决定性作用。
1.引言
氟是卤素家族的成员在环境中广泛分布。大部分的氟存在于无机或有机化合物中，它在自然界中有很重要的地位。众所周知，低浓度的氟对牙齿和骨骼的发育是很有益的，然而长期摄入过量的氟会对人类和动物产生不利的影响，例如氟骨症，也会导致植物中叶绿素和蛋白质的减少。氟化物通过自然合成和人为加工的方式进入到环境中，这些过程导致了含氟化合物在地下水和地表水中的积聚。虽然未被污染的淡水中也含有低水平的氟，其浓度却可以因肥料流失，采矿业，工业排放而增加。据报道，我国地下水氟含量的氟中毒地区为2.3-8 mg / L。沸水中的氟含量通常超过5 mg / L，甚至是45 mg / L。含氟工业沸水中的氟含量在96.8 mg / L，在极端的情况下可达到3000-5000 mg / L。在中国养鱼用水主要来自自然水体，例如地下水，井水和温泉。这些水氟含量会相对高于标准对渔业可能有负面影。鱼类直接从水中摄取氟化物，是直接受到水生生态系统氟化物污染影响的生物。高浓度的氟化物会导致毒性作用, 溶液聚合如对鱼产生抑制生长和发育，增加死亡率,鳃和肝组织的病变、氟化物积累和畸形的骨组织，代谢紊乱、生态压力。鲤鱼，是世界上最重要的淡水鱼繁殖物种之一，拥有最大的体型，分布最广泛，养殖历史最长，产量最高。肝脏是鲤鱼最大的消化腺，因包含许多功能而对鱼类非常重要。例如，它可以分泌胆汁，从血液中过滤
不相关的物质并通过胆管排出；它可以合成人体所需的各种蛋白质，合成和分解糖原，包括维生素和激素的代谢；它也可以通过改造或结合有毒物质生成低毒或无毒物质消除或减少毒物对身体的伤害，或吸收有毒物质通过胆汁或尿液排出；巨噬细胞在肝脏中具有较强的吞噬能力，可以消除细菌、有害物质和老化的白细胞。氟化物对肝脏健康和功能的潜在负面影响现在还没有详细的调查，因此，我们研究暴露在不同氟化物浓度下，对鲤鱼细胞的抗氧化活性，脂质过氧化作用，组织病理学和细胞凋亡的影响。
2. 材料和方法
2.1 实验动物
取自太原鱼类孵化场年轻健康的鲤鱼，平均长度（12.0 ± 0.38）cm，重量（15.8±0.24）g。已经被关在实验室的鱼缸里15天，以适应实验室环境。在适应环境过程中，喂以在市场上随机买到的饲料。
2.2 氟暴露
750只健康的鲤鱼被随机分为五组，每组150只。每组再分为三小组，每小组50只。对照组
曝光在不含氟的水中90天，其余四组分别曝光在浓度为40,80,120,160,mg/L的氟化钠中90天。将水质保持在如下条件下：水温，22-24℃；pH，6.8-7.2；氧容量，5-7mg/L；硬度为CaCO3，20.0 mg/L；电导率，650lS/cm。重金属浓度为零或不可能被发现，水的组成符合渔业水质标准。水每七天换一次和水族箱每七天打扫一次。使用氟离子选择性电极方法监测每个组每天的氟化物浓度，保证在7天间每个槽之间的氟化物浓度相对稳定。
解剖之前，将鱼麻醉置于冰上。在暴露后的30,60和90天时，从每组中随机挑出18条鱼将其肝脏取出收集。在准备期间将收集来的肝脏置于干冰上然后储存于-80℃直至分析酶活。在90天的曝光期后，取出一部分肝脏组织用生理盐水冲洗，然后快速固定在4%中性甲醛中待微观研究，放在2.5%戊二醛中待超微结构的研究，放在4%的多聚甲醛中待做凋亡判断和免疫组化分析。
2.3 分析过程
手机肝脏样本后，按1:10的比例加入0.86%的生理盐水并在冰上制成匀浆，4℃，1200rpm离心8李德金后台分钟。制成的匀浆将被用于测定SOD，MDA，GSH的表达水平。SOD的活性用黄嘌呤氧化酶和氮蓝四唑方法测定。SOD被定义为一个单位的酶抑制率明显减少了50%。MDA
含量化验使用硫代巴比土酸技术。GSH的浓度则以5，5-二硝基苯甲酸的化学方法测定。蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定并用牛血清蛋白作为标准蛋白。用紫外可见分光光度计测定SOD，MDA，GSH和蛋白质的吸光值，其峰值分别设定为550，532，412，595。
在用光学显微镜(RCH1-NK50i, Japan Nikon)观察鱼的标本之前，先把鱼组织用梯度乙醇脱水然后用石蜡固定(Paraffin machine, Leica RM 2245, German)。在室温下，用旋转式石蜡切片机将固定的鱼标本切成5-m薄片并用伊红和苏木精染。切片在分级乙醇中脱水后用DPX封片留以光学显微镜观察。用以透射电镜(JEM-1400, Japan)观察的组织，先用1%的锇酸固定再用分级乙醇脱水。用树脂切片机将树脂切成50-nm薄片并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染。
对于细胞凋亡的测定，我们先把5m的石蜡切片进一步用TUNEL处理试验，其过程遵循细胞凋亡检测设备的协议。在短时间内，将石蜡切片脱蜡，水化并用以PBS现配3%的双氧水孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶。每个切片用10 ug/ml的K/TBS蛋白酶溶液在37℃温度下浸染10分钟。将组织浸入20 ul的末端转移酶溶液中在37℃下孵育2h。切片用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，在37℃下，覆盖30min，然后用DAB染15分钟，最后用苏木
精对细胞核染30s。阳性细胞的细胞核中会发现棕黄颗粒。DNase1-treated 组织用于阳性对照，没有与TdT酶反应的组织作为阴性对照。凋亡系数是指，在20倍物镜不重叠视野下随机挑选的细胞中阳性细胞数与总细胞的百分比。
用于免疫组化分析的兔抗IgG POD试剂盒购买于中国博士德公司。用免疫组化的方法来分析钢水净化剂Bcl-2和Bax蛋白的表达，组织样本用特定的抗-Bcl-2和抗-Bax抗体来进行免疫组化分析。将组织切片脱蜡，水化，并用3%的过氧化氢溶液孵育5分钟来灭活内源性酶。切片用PBS缓冲液清洗后，用10%的标准山羊血清孵育来阻止非特异性结合，4℃过夜后用以下主要抗体进行检测：兔多克隆抗-Bcl-2（中国博士德公司）（1:100）和抗-Bax（中国博士德）（1:150）。接着，用生物素化的山羊兔抗IgG（中国博士德）（1:1000）在室温下处理3h，然后用链霉亲和素辣根过氧化物酶室温下处理30分钟。过氧化氢酶的活性可以通过用含有DAB的Tris-HCl缓冲液包括0.03%的过氧化氢处理10分钟后的结果来直观看出。组织切片可以用莱卡2500显微镜（德国）来观察和拍照，彩强度反映了Bcl-2和Bax蛋白的表达系数。
2.4 系统分析
数据包括SOD，MDA和GSH的数值，可以用±S表示。可以用Tukey多重比较法，对对照组和实验组的差异性进行单因素方差分析，在95%的置信区间。氟化物浓度与SOD，MDA，GSH，凋亡指数，Bax，Bcl-2表达水平和Bcl-2/Bax之间的相关性分析，用皮尔森相关系数法进行分析。
3. 结果
3.1 氟化物对SOD，谷胱甘肽活性和肝脏脂质过氧化作用的影响。
为了研究氟化物对脂质过氧化作用和抗氧化剂酶活性，SOD，GSH活性和MAD含量的潜在影响，本实验检测了暴露在不同氟化物浓度下的年轻鲤鱼，分别在30，60和90天时的各项数据.
在氟化物暴露后的30，60，90天SOD的活性可以在图1a中看到。在30天的暴露后，实验组的鲤鱼体内的SOD活性首先上升然后下降。肝脏组织中的SOD活性为63.3 mg/L，与对照组有显著差异(p< 0.05)，与其他实验组相比并没有明显差异(p> 0.05)。在60天的暴露后，暴露在77.7和
124.4 mg/L浓度中的鲤鱼肝脏细胞中的SOD活性与对照组相比明显下降(p< 0.05)。在90天的暴露后，高剂量达63.3，77.7，和124.4 mg/L中的SOD活性与对照组相比有显著抑制(p< 0.05)，其抑制率分别为10.1%，18.8%，23.3%。氟化物浓度与SOD活性之间出现负相关(r= -0.972)。
利于肝脏组织中的GSH浓度可以在图1b中看出。图中显示，经过30天的氟化物处理其浓度有开始增加的趋势然后下降，另外，与对照组相比，其浓度只在124.4 mg/L浓度组中出现抑制(p< 0.05)。其他组的酶含量并没有显著差异(p> 0.05)。在60天的暴露后，最高浓度组的酶水平和对照组相比显著下降，和其他浓度组相比没有明显变化。在90天暴露后，实验组出现了计量依赖性，特别是在77.7和124.4 mg/L浓度组中。结果表明，氟化物浓度与GSH水平之间呈负相关。
鲤鱼肝脏中MDA表达水平可以在图1c中看出。在30天的暴露后，124.4 mg/L浓度组鲤鱼肝脏组织中的MDA表达水平明显高于对照组。在60天后，124.4 mg/L浓度组鲤鱼肝脏组织中的MDA表达水平明显高于对照组。在90天后，63.3，77.7，124.4 mg/L浓度组鲤鱼肝脏组织中的MDA表达水平均明显高于对照组。在MDA表达水平与氟化物浓度之间有一个正相关。以上结果表明，鲤鱼在经过氟化物暴露后会有严重的氧化损伤。
3.2 氟化物对鲤鱼肝脏组织微观结构的影响。
图2为光学显微镜下，氟暴露90天后的鲤鱼肝脏组织的病理学变化。
如图2所示，对照组为正常的肝脏组织结构，肝脏细胞近于圆形，形状规则，细胞边界透明。细胞核接近于圆形或椭圆形，位于细胞中央（图2a）。在90天的暴露后，不同的病理变化被发现。暴露在35.1 mg/L浓度组中的鲤鱼肝脏细胞出现不规则排列和空泡变性（图2b）。暴露在63.3 mg/L浓度组中的鲤鱼肝脏细胞出现无序排列和断裂的细胞索，加剧了空包变性（图2c）。也有更多严重的损伤，例如核收缩和细胞容积，肝正弦曲线增大，另外，消失的肝脏细胞结构在77.7 mg/L浓度组中重新出现（图2d）。最严重和最明显的损伤出现在最高浓度组，如，断裂的肝组织，肝细胞组织消失，肝组织局部坏死（图2e电解液比重计）。
3.3 氟化物对鲤鱼肝脏组织超微观结构的影响。
利用投射式电子显微镜，可以观察到氟暴露90天后不同浓度下的肝脏组织树脂切片的超微观结构的变化。
复合纸如图3所示，对照组正常的肝脏组织结构为，一个或多个椭圆形细胞核低密度聚集可见明显的核仁，整体结构和明显可见的双核膜和核孔，丰富的线粒体，内质网和细胞质里的核糖体（图3a）。在90
天的暴露后，35.1 mg/L浓度组的肝脏细胞中只发现了朦胧的线粒体结构（图3b）。63.3 mg/L浓度组的肝细胞中只发现了模糊的肝细胞核膜，模糊的线粒体嵴和肿胀的内质网（图3c）。77.7 mg/L浓度组中的肝细胞核孔的直径增加，线粒体和内质网的数量减少，线粒体嵴消失，核糖体和液泡的数量增加（图3d）。最明显和严重的损伤在最高浓度组中被发现，细胞核收缩变形，核膜缺陷，染质凝结，线粒体解体从而数量减少，细胞收缩，高胞质电子密度（图3e）。
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