癌症的方法与流程

癌症的方法1.相关申请的交叉引用2.本发明要求2020年1月30日提交的以列专利申请号为272390的优先权，其全部内容通过引用并入本文。3.序列表声明4.与本发明同时提交的、创建于2021年1月28日名为85623序列表.txt(85623sequencelisting.txt)的ascll文件包括24,576字节，该文件通过引用并入本文。5.本发明的

技术领域

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：和

背景技术

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：：6.本发明在其一些实施方式中涉及通过降低髓样细胞的免疫抑制活性来癌症的方法，更具体地，但不排他地，涉及实体癌(solidcancers)。7.免疫功能的许多重要决定因素无法通过传统的表面标记精确地表征，目前尚不清楚这些信号的内部处理和集成如何转化为免疫激活、抑制和炎症。已知髓源性抑制细胞(myeloidderivedsuppressorcells，mdsc)促进肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)内的效应t细胞的抑制环境，并支持肿瘤生长和免疫功能障碍。尽管mdsc对多种人类疾病和癌症类型的结果具有重要影响，但其精确的功能作用和分子特性难以解释，并且模糊不清。mdsc不符合常规的基于表面标记的分类方案，而是使用广泛的髓样表面标记、各种细胞测定和代谢特性(包括表达精氨酸酶1(arg1)的免疫抑制性代谢途径的表达)进行分类。基于其抑制代谢潜能，对这一重要且异质的髓样细胞进行彻底的分子理解，可能导致对它们的分子标记物、途径和活性的识别，最终导致更有效的生物标记物和靶向免疫。8.

背景技术

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：文献包括：kim等人，癌症(cancers)(basel)，2019年9月；11(9):1315；wo2017/058866和申请号为20180043014的美国专利申请。技术实现要素：9.根据本发明的一个方面，提供了一种降低髓样细胞免疫抑制活性的方法，所述方法包括使髓样细胞与有效量的试剂接触，所述有效量的试剂特异性降低表达髓样细胞触发受体2(triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells2，trem2)和跨膜糖蛋白nmb(transmembraneglycoproteinnmb，gpnmb)两者的髓样细胞的量和/或活性，从而降低髓样细胞的所述免疫抑制活性。10.根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的主体(subject)中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的试剂，所述试剂特异性下调表达髓样细胞触发受体2(trem2)和跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)两者的主体的髓样细胞的量和/或活性，从而所述癌症。11.根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括：12.(a)根据权利要求3所述的方法降低髓样细胞的免疫抑制活性，其中所述髓样细胞来自所述主体；随后13.(b)将所述髓样细胞移植至所述主体，从而所述癌症。14.根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的：15.(i)第一试剂，所述第一试剂下调trem2的量和/或活性；和16.(ii)第二试剂，所述第二试剂特异性下调gpnmb的量和/或活性，17.从而所述癌症。18.根据本发明的一个方面，提供了一种双特异性抗体，包括能够特异性结合trem2的第一抗原结合结构域和能够特异性结合gpnmb的第二抗原结合结构域。19.根据本发明的一个方面，提供了一种主体癌症的方法，包括：20.(a)分析所述主体样品中表达trem2和gpnmb两者的髓样细胞的存在；和21.(b)当所述髓样细胞的量高于预定量时，用有效量的靶向trem2和/或gpnmb的所述试剂主体；或者当所述细胞的量低于预定量时，用有效量的化疗剂所述主体，所述化疗剂不同于靶向trem2和/或gpnmb的所述试剂。22.根据一些实施方式，所述接触在体内进行。23.根据一些实施方式，所述接触在体外(exvivo)进行。24.根据一些实施方式，所述试剂包括双特异性抗体。25.根据一些实施方式，所述双特异性抗体的第一靶标是trem2，所述双特异性抗体的第二靶标是gpnmb。26.根据一些实施方式，所述第一试剂和所述第二试剂是抑制性抗体。27.根据一些实施方式，所述双特异性抗体与细胞毒性剂结合。28.根据一些实施方式，所述癌症是实体癌。29.根据一些实施方式，所述实体癌选自由肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌组成的组。30.根据一些实施方式，所述肺癌是非小细胞肺癌。31.根据一些实施方式，所述肺癌是小细胞肺癌。32.根据一些实施方式，所述肝癌是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)。33.根据一些实施方式，所述方法还包括向所述主体施用有效量的检查点抑制剂。34.根据一些实施方式，所述方法还包括向所述主体施用有效量的布鲁顿酪氨酸激酶(brotonstyrosinekinase,btk)抑制剂。35.根据一些实施方式，所述布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂选自由依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡替尼(acalabrutinib)和司培替尼(spebrutinib)组成的组。36.根据一些实施方式，靶向trem2和/或gpnmb抗体的所述试剂是抗体。37.根据一些实施方式，所述双特异性抗体与细胞毒性剂结合。38.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中，可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，下文描述示例性的方法和/或材料在下面描述。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而非限制性的。39.附图的简要说明40.本文仅通过示例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方式。现在具体参照附图详图，需要强调的是，所示的细节是示例，是为了对本发明的实施方式进行说明性的讨论。在这一点上，结合附图进行的描述使得本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方式。41.在附图中：42.图1：ins-seq：一种用于scrna-seq和细胞内蛋白检测的集成技术。a.ins-seq实验方法的示意图。43.图2a-g：trem2定义了两种肿瘤浸润抑制髓样细胞。a.实验设计示意图。b.来自8580个细胞的42个基因的基因表达热图聚集成arg1+和arg1-细胞的77个元细胞(metacells)。上面的柱状图示出了arg1富集分数(arglenrichmentscore)(arg1+相对于arg1-样品的分数(fractionintheargl+overargl-samples))。c.arg1+和arg1-元细胞内42个标记基因的基因-基因皮尔逊相关性热图(gene-genepearsoncorrelationheatmap)。上面的柱状图示出了基因表达与arg1富集分数之间的皮尔逊相关性。d.与ly6c+相比，不同细胞中arg1和trem2(e)表达倍数变化的qpcr分析。f.代表从mca205cd45+cd11b+分离的细胞的pdpn对ly6c、cx3cr1和gpnmb的流式细胞仪图(flowcytometryplots)。g.mca205cd45+免疫细胞的cytof数据的umap投影。检测到的arg1、pdpn、ly6c、trem2和cx3cr1的蛋白质水平由图中所示的颜梯度显示。44.图3a-h：trem2促进t细胞功能障碍和肿瘤免疫逃逸。a.代表12081个髓样细胞的115个元细胞的二维图投影。如图所示，不同的颜代表不同的细胞。b.将关键标记基因投影到图上。c.示出与单核细胞(monocytes，ace)(x轴)相比的mregs(y轴)的平均umi计数(log2标度)的散点图。d.示出与单核细胞(monocytes，ace)(x轴)相比tams(y轴)的平均umi计数(log2标度)的散点图。e.示出每个簇(cluster)的调控区域中转录因子结合位点富集的热图。在相关的簇中，只有具有显著的归一化富集分数(nes》3.5)和平均表达高于0.1umi的tfs被示出。f.在mca205肿瘤微环境中wt和trem2ko中关键细胞的百分比(第19天)。每个点代表一只动物；黑线表示平均百分比。g.wt和trem2ko小鼠(mice)的mca205肿瘤体积(第19天)。每个点代表一只动物，红线代表平均体积。误差线表示平均值±sem(p＝0.007，单向方差分析(one-wayanova))。h.用于t细胞增殖分析的流式细胞仪直方图，示出了用抗-cd3/抗-cd28刺激并与mca205肿瘤内cd11b+ccr2+(mon)、cx3cr1+(tam)或gpnmb+(mreg)细胞共培养48小时的wt脾cd8t细胞的细胞增殖染料efluortm450荧光信号。45.图4a-f：trem2定义了两种肿瘤浸润抑制髓样细胞。a.示出了分选(sorting)cd45+cd11b+arg1+细胞的门控策略(gatingstrategy)的facs图。b.tme中ins-seqarg1+和arg1-细胞中arg1mrna的qpcr值。c.示出了与arg1+与arg1-细胞(x轴)中富集分数(log2标度)相比，77个元细胞(y轴)中所选基因(arg1、trem2、ctsl和plac8)的平均umi计数的散点图。比例尺表示富集分数。d.代表8156arg1+和arg1-细胞的77个元胞的二维图投影。颜表示arg1+中log2的富集。e.条形图示出了所示基因表达(x轴)与arg1蛋白比率相关。f.mca205cd45+免疫细胞的cytof数据的umap投影。如图中所示，检测到的所示蛋白质的蛋白水平以颜梯度显示。46.图5a-c：trem2促进t细胞功能障碍和肿瘤免疫逃逸。a.表示来自wt和trem2ko小鼠的mca205(第19天)的15,946个肿瘤内cd45+的82个元细胞的二维图投影。b.示出了12个元细胞标记基因的调控区域中转录因子结合位点富集的热图。只有具有显著的归一化富集分数(nes》3.5)和平均表达高于0.1umi的tfs被示出。c.来自wt(上部肿瘤图像)和trem2ko(下部肿瘤图像)的mca205肿瘤图像。47.本发明具体实施方式的描述48.本发明在其一些实施方式中涉及通过降低髓样细胞的免疫抑制活性来癌症的方法，更具体地，但不排他地，涉及实体癌。49.在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本发明在其应用中不一定局限于以下描述中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实践或实现。50.本发明人使用直接靶向arg1+髓样细胞来分析肿瘤微环境内的抑制性代谢回路。它们在肿瘤中识别了两种不同的arg1+trem2+细胞：肿瘤相关的巨噬细胞和独特的mreg，其特征在于限定的表面标记物(例如gpnmb)和信号传导，包括缺氧。它们证明了arg1+tam和mreg对cd8t细胞的抑制活性。目前的研究结果发现trem2为抑制性髓样细胞的标记物和潜在调节剂。小鼠中trem2的基因切除(geneticablation)导致mreg显著减少，对肿瘤的免疫反应性增加，包括功能障碍性cd8+t细胞减少，nk和细胞毒性t细胞增加。结果表明，特异性靶向mreg比靶向肿瘤相关巨噬细胞更有利于癌症。51.因此，根据本发明的第一方面，提供了一种降低髓样细胞的免疫抑制活性的方法，所述方法包括使髓样细胞与有效量的试剂接触，所述试剂特异性降低表达髓样细胞触发受体2(triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells2，trem2)和跨膜糖蛋白nmb(transmembraneglycoproteinnmb，gpnmb)两者的髓样细胞的量和/或活性，从而降低髓样细胞的免疫抑制活性。52.本文所用的术语“髓样细胞(myeloidcells)”是指由髓系祖细胞(commonmyeloidprogenitor，cmp)产生的细胞。在一个实施方式中，髓样细胞是由成髓细胞的谱系及其子代类型(例如嗜碱性粒细胞(basophils)、嗜中性粒细胞(neutrophils)、嗜酸性粒细胞(eosinophils)、单核细胞和巨噬细胞)产生的细胞。髓样细胞的一个亚组(subgroup)是免疫抑制性髓样细胞。53.trem-2是主要在骨髓系细胞(myeloidlineagecells)上表达的免疫球蛋白样受体，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、破骨细胞、小胶质细胞、单核细胞、皮肤朗格汉斯细胞(langerhanscellsofskin)和库普弗细胞(kupffercells)。在一些实施方式中，trem-2与dap12形成受体信号传导复合物。在一些实施方式中，trem-2通过dap12(一种itam结构域衔接蛋白(itamdomainadaptorprotein))磷酸化并进行信号传导。在一些实施方式中，trem-2信号传导导致pi3k的下游激活。在一些实施方式中，trem-2信号传导导致脾酪氨酸激酶(spleentyrosinekinase，stk)的下游磷酸化。54.本发明的trem-2蛋白包括但不限于哺乳动物trem-2蛋白，哺乳动物trem-2蛋白包括，但不限于，人trem-2蛋白(蛋白质分析数据库(uniprot)登录号q9nzc2)、小鼠trem-2蛋白(uniprot登录号q99nh8)、大鼠trem-2蛋白(uniprot登录号d3zz89)、恒河猴trem-2蛋白(uniprot登录号f6qvf2)、牛trem-2蛋白(uniprot登录号q05b59)、马trem-2蛋白(uniprot登录号f7d6l0)、猪trem-2蛋白(uniprot登录号h2ezz3)和狗trem-2蛋白(uniprot登录号e2rp46)。55.示例性的人trem-2氨基酸序列如下文序列号49(seqidno：49)所示。56.在一些实施方式中，人类trem-2是包括信号肽的前蛋白。在一些实施方式中，人类trem-2是成熟蛋白。在一些实施方式中，成熟trem-2蛋白不包括信号肽。在一些实施方式中，成熟trem-2蛋白在细胞上表达。在一些实施方式中，trem-2含有位于人类trem-2(seqidno：49)的氨基酸残基1-18处的信号肽；位于人类trem-2(seqidno：49)的氨基酸残基29-112处的细胞外免疫球蛋白样可变型(immunoglobulin-likevariable-type，igv)结构域；位于人类trem-2的氨基酸残基113-174的其它细胞外序列(seqidno：49)；位于人类trem-2(seqidno：49)的氨基酸残基175-195的跨膜结构域；和位于人类trem-2的氨基酸残基196-230的细胞内结构域(seqidno：49)。57.跨膜糖蛋白nmb(transmembraneglycoproteinnmb，gpnmb)是ia型细胞表面糖蛋白。示例性的gpnmb具有seqidno：50所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，术语gpnmb是指其类似物、衍生物或片段；或包含gpnmb、其类似物、衍生物或片段的融合蛋白。在某些实施方式中，术语“gpnmb”是指指成熟的、加工形式的gpnmb。在其它实施方式中，术语“gpnmb”是指gpnmb的细胞外结构域。58.如所提及的，试剂与主体的髓样细胞接触，以减少所述髓样细胞中表达trem2和gpnmb两者的特定亚(subpopulation)的量和/或活性。59.在一个实施方式中，所述接触在体内进行。60.在另一实施方式中，所述接触是在体外进行，即从主体中取出髓样细胞，随后与所述试剂接触。61.通常通过骨髓活检从主体中取出髓样细胞。62.本发明这方面的试剂特异性地降低表达髓样细胞触发受体2(trem2)和跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)两者的髓样细胞的量和/或活性。63.在一个实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记物的细胞的量减少至少2倍。在另一实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记物的细胞的量减少至少5倍。在另一实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记物的细胞的量减少至少10倍。64.在一个实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记物的细胞的活性降低至少2倍。在另一实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记物的细胞的活性降低至少5倍。在另一实施方式中，与仅表达一种标记物(即仅表达trem2而不表达gpnmb，反之亦然)的细胞相比，该试剂将表达两种标记的细胞的活性降低至少10倍。65.本文所述的本发明这方面的试剂可与trem-2和gpnmb两者结合，其中kd《1×10-7m。在另一实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人trem-2和人类gpnmb两者结合，其中kd《5×10-8m。在另一实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《1×10-8m。在某些实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《5×10-9m。在其它实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《1×10-9m。在一个具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《5×10-10m。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《1×10-10m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb两者结合，其中kd《1×10-11m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb两者结合，其中kd《1×10-12m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《1×10-13m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人gpnmb两者结合，其中kd《1×10-13m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb两者结合，其中kd《1×10-14m。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb两者结合，其中kd《1×10-15m。66.使用多种技术测定亲和力，其中一个示例是亲和力酶联免疫法测定(elisaassay)。在各种实施方式中，通过表面等离子体共振测定法(例如，基于的测定)来确定亲和力。使用该方法，可以测量结合速率常数(associationrateconstant，ka)和解离速率常数(dissociationrateconstant，kd)。然后可以从动力学速率常数(kineticrateconstant，kd/ka)的比率计算平衡解离常数(equilibriumdissociationconstant，kd，单位为m)。在一些实施方式中，亲和力是通过动力学方法测定的，如rathanaswami等人的动力学排阻测定(kineticexclusionassay，kinexa)，分析生物化学(analyticalbiochemistry)，vol.373:52-60,2008。使用kinexa测定，可以测量平衡解离常数(kd，单位为m)和结合速率常数(ka，单位为m'v1)。可以从这些值(kd×ka)计算出解离速率常数(kd)。在其它实施方式中，亲和力是通过生物层干涉测量法来确定的，例如kumaraswamy等人在分子生物学方法(methodsmol.biol.)，vol.1278:165-82,2015，并用于系统(pallfortebio)。可以使用生物层干涉测量法实时计算动力学(ka和kd)和亲和力(kd)常数。在一些实施方式中，本文所述的抗原结合蛋白表现出期望的特征，例如通过kd(解离速率常数)测量的人类trem-2和人类gpnmb的结合亲和力为约10-2、10-3、10-4、10-5、10-6或更低(较低的值表示较高的结合亲和力)，和/或通过kd(平衡解离常数)测量的人类trem-2和人类gpnmb的结合亲和力为约10-8、10-9、10-10、10-11m或更低(较低的值表示较高的结合亲和力)。在某些实施方式中，本发明的抗原结合蛋白特异性结合人类trem-2和人类gpnmb，其中kd为约1pm至约100nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。例如，在一些实施方式中，本发明的抗原结合蛋白特异性结合人类trem-2和人类gpnmb，其中kd小于100nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。在其它实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb特异性结合，其中kd小于50nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。在其它实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb特异性结合，其中kd小于25nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。在一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb特异性结合，其中kd小于10nm，通过生物层干涉测量法在25℃测量。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb特异性结合，其中kd小于5nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。在另一具体实施方式中，本发明的抗原结合蛋白与人类trem-2和人类gpnmb特异性结合，其中kd小于1nm，如通过生物膜层干涉技术在25℃测量。67.根据一个实施方式，本发明这方面的试剂是识别两种不同抗原(trem-2和gpnmb)的双特异性抗体、多价抗体(multivarientantibody)或嵌合抗体。68.本发明的“双特异性抗体(bi-specificantibody)”具有两个不同的抗原结合位点，使得抗体特异性结合两个不同的抗原。这种抗体可以通过组合识别两个不同抗原基团的两个单独抗体或抗体片段的部分或修饰单个抗体分子以包含两个特异性(如上文详细讨论的)来产生。69.根据一个实施方式，双特异性抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的杂合抗体。70.根据一个实施方式，双特异性抗体在抗体的结构环区(例如重链的ch3区)中包含抗原识别结构域。因此，双特异性抗体可以包含抗体片段，该抗体片段包含称为“fcab”的抗体的fc区。这种抗体片段通常包含抗体的ch2-ch3结构域。fcabs被工程化以在抗体的结构环区，即重链的ch3区，中包含至少一个修饰。这种抗体片段可以例如以如下方式产生：提供编码包含至少一个结构环区(例如fc区)的抗体的核酸，修饰至少一个结构环区的至少一个核苷酸残基，在表达系统中转移经修饰的核酸，表达经修饰的抗体，使经表达的经修饰的抗体与表位接触，并确定经修饰的抗体是否与表位结合。参见，例如，公开号为9,045,528和9,133,274的美国专利，其通过引用整体并入本文。71.也可以制备具有更高价态(即，结合两种以上抗原的能力)的抗体；它们被称为多特异性抗体。72.由于本文描述的方法用于降低髓样细胞的免疫抑制活性，本发明人认为该方法可用于癌症。73.因此，根据本发明的另一方面，提供了一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的试剂，所述试剂特异性下调表达髓样细胞触发受体2(trem2)和跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)两者的主体的髓样细胞的量和/或活性，从而所述癌症。74.如本文所用，“主体(subject)”是指被诊断患有癌症的哺乳动物，例如人类。75.上文描述了能够特异性降低表达trem2和gpnmb的主体的髓样细胞的量和/或活性的试剂。76.术语“癌症(cancer)”和“癌性的(cancerous)”是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型地特征是不受调节的恶性细胞生长。77.可根据本发明的一些实施方式可以分析和的癌症的示例包括但不限于胃肠道肿瘤(结肠癌、直肠癌、结肠直肠肿瘤(colorectalcarcinoma)、结肠直肠癌(colorectalcancer)、结直肠腺瘤(colorectaladenoma)、遗传性非息肉病1型、遗传性非息肉病2型、遗传性非息肉病3型、遗传性非息肉病6型、结肠直肠癌(colorectalcancer)、遗传性非息肉病7型、小和/或大肠癌、食道癌、伴有食道癌的胼胝症(tylosiswithesophagealcancer)、胃癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤)；子宫内膜癌；隆凸性皮肤纤维肉瘤；胆囊癌；胆道肿瘤；前列腺癌(prostatecancer)；前列腺腺癌(prostateadenocarcinoma)；肾癌(维尔姆斯瘤(wilms’tumor)2型或1型)；肝癌(例如肝母细胞瘤、肝细胞肿瘤(hepatocellularcarcinoma)、肝细胞癌(hepatocellularcancer))；膀胱癌；胚胎性横纹肌肉瘤；生殖细胞肿瘤；滋养细胞肿瘤；睾丸生殖细胞肿瘤；卵巢未成熟畸胎瘤；子宫；上皮性卵巢；骶尾部肿瘤(sacrococcygealtumor)；绒毛膜癌；胎盘部位滋养细胞肿瘤；上皮性成人肿瘤(epithelialadulttumor)；卵巢癌；浆液性卵巢癌；卵巢性索肿瘤；宫颈癌；子宫颈癌；小细胞和非小细胞肺癌；鼻咽癌；乳腺肿瘤(breastcarcinoma)(例如，导管型乳腺癌、浸润性导管型乳腺癌、散发性乳腺癌；乳腺癌(breastcancer)；对乳腺癌易感性(susceptibilitytobreastcancer)；4型乳腺癌；乳腺癌-1，乳腺癌-3；乳腺-卵巢癌(breast-ovariancancer))；鳞状细胞癌(例如，在头部和颈部)、神经源性肿瘤；星形细胞瘤；神经节母细胞瘤(ganglioblastoma)；成神经细胞瘤(neuroblastoma)；淋巴瘤(例如，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、b细胞瘤、伯基特(burkitt)瘤、皮肤t细胞瘤、组织细胞瘤、成淋巴细胞瘤、t细胞瘤、胸腺瘤)；神经胶质瘤；腺癌；肾上腺肿瘤；遗传性肾上腺皮质癌；脑恶性肿瘤(brainmalignancy/tumor)；各种其它癌(例如，支气管源性大细胞癌、导管癌、埃利希-莱特腹水(ehrlich-lettreascites)癌、表皮样癌、大细胞癌、lewis肺癌、髓样癌、粘液表皮样癌、燕麦细胞癌、小细癌、梭形细胞癌、棘细胞癌、移行细胞癌、未分化癌、癌肉瘤、绒毛膜癌、囊腺癌)；室管膜母细胞瘤(ependimoblastoma)；上皮瘤；红白血病(例如，弗兰德(friend)红白血病、淋巴母细胞红白血病)；纤维肉瘤；巨细胞瘤；神经胶质瘤；成胶质细胞瘤(例如，多形性、星形细胞瘤)；胶质瘤肝细胞瘤(gliomahepatoma)；异源杂交瘤(heterohybridoma)；杂合骨髓瘤(heteromyeloma)；组织细胞瘤；杂交瘤(例如，b细胞)；肾上腺样瘤；细胞性胰岛细胞瘤(insulinoma)；胰岛肿瘤；角质瘤；成平滑肌瘤(leiomyoblastoma)；平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)；淋巴肉瘤；黑素瘤；乳腺肿瘤；肥大细胞瘤；成神经管细胞瘤；间皮瘤；转移性肿瘤；单核细胞肿瘤；多发性骨髓瘤；骨髓增生异常综合征；骨髓瘤；肾母细胞瘤；神经组织胶质肿瘤；神经组织神经元肿瘤；神经鞘瘤；成神经细胞瘤；少突胶质细胞瘤；骨软骨瘤；骨髓瘤(osteomyeloma)；骨肉瘤(例如，尤因氏骨肉瘤)；乳头状瘤、移行细胞、嗜铬细胞瘤、垂体瘤(侵袭性)；浆细胞瘤；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；肉瘤(例如，尤文氏肉瘤、组织细胞肉瘤、延森肉瘤、成骨肉瘤、网状细胞肉瘤)；神经鞘瘤；皮下肿瘤；畸胎癌(teratocarcinoma)(例如多能的)；畸胎瘤(teratoma)；睾丸肿瘤；胸腺瘤和毛发上皮瘤；胃癌；纤维肉瘤；多形性成胶质细胞瘤；多发性血管球瘤；李佛美尼症候(li-fraumenisyndrome)；脂肪肉瘤；林奇癌家族综合征ii(lynchcancerfamilysyndromeii)；男性生殖细胞肿瘤；肥大细胞白血病；甲状腺髓样瘤(medullarythyroid)；多发性脑膜瘤；内分泌肿瘤粘液肉瘤(endocrineneoplasiamyxosarcoma)；副神经节瘤；家族性非嗜铬细胞瘤(familialnonchromaffin)；毛母质瘤；乳头状瘤(papillary)；家族性和散发性肿瘤(familialandsporadic)；横纹肌样易感性综合征；家族性肿瘤(familial)；横纹肌样瘤；软组织肉瘤和透克氏综合征伴成胶质细胞瘤(turcotsyndromewithglioblastoma)。78.根据一个具体实施方式，所述癌症是黑素瘤。79.根据一个具体实施方式，所述癌症是实体肿瘤(solidtumor)(肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌)。80.根据一个具体实施方式，所述癌症是原发肿瘤。81.根据一个具体实施方式，所述癌症是转移性的。82.根据一个具体实施方式，所述癌症是继发性肿瘤。83.根据一个具体实施方式，所述肺癌是非小细胞肺癌。84.根据一个具体实施方式，所述肺癌是小细胞肺癌。85.根据一个具体实施方式，所述肝癌是肝细胞癌。86.根据本发明的另一方面，提供了一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的：87.(i)第一试剂，所述第一试剂下调trem2的量和/或活性；和88.(ii)第二试剂，所述第二试剂特异性下调gpnmb的量和/或活性，89.由此癌症。90.根据一个实施方式，第一试剂特异性结合在髓样细胞上表达的trem-2。根据另一个实施方式，第二试剂特异性结合gpnmb。短语“特异性结合(specificallybind(s)或bind(s)specifically)”当涉及结合分子时，是指专门或主要地针对靶分子(例如trem-2或gpnmb)具有中等或高结合亲和力的分子。短语“特异性结合至(specificallybindsto)”是指在蛋白质和其它生物制剂的异质细胞存在的情况下，确定靶蛋白(例如trem-2或gpnmb)存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，特定的结合分子(specifiedbindingmolecules)优先结合特定的靶蛋白(例如trem-2或gpnmb)，并且不会大量结合测试样品中存在的其它组分。在这样的条件下与靶蛋白的特异性结合可能需要结合分子，该结合分子是根据其对特定靶蛋白的特异性而选择的。多种测定形式可用于选择与特定靶蛋白特异性反应的结合分子。例如，固相elisa免疫测定、免疫沉淀、生物分子相互作用分析系统(biacore)和蛋白质印迹(westernblot)可用于鉴定特异性结合trem-2或gpnmb的结合分子。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更通常是背景信号或噪声的10倍以上。考虑到结合分子是抗体，短语“特异性结合至(specificallybindsto)”是指在蛋白质和其它生物制剂的异质细胞存在的情况下，确定抗原(例如trem-2或gpnmb)存在的结合反应。通常，特异性结合抗原的试剂以至少约1×10-6至1×10-7，或约1×10-8至1×10-9m，或约1×10-10至1×10-11或更高的解离常数(kd)结合抗原；和/或结合预定抗原(例如trem-2或gpnmb)的亲和力比其与预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如bsa，酪蛋白)结合的亲和力高至少两倍、五倍、十倍、二十倍。91.根据一个具体实施方式，降低trem-2的量和/或活性的试剂是抑制剂抗体(inhibitorantibody)，在本文中也称为拮抗剂抗体(antagonistantibody)。92.本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子及其功能片段，如fab、f(ab')2、fv或针对抗原表位的单结构域分子如vh和vl。这些功能性抗体片段定义如下：(1)fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体产生完整的轻链和一条重链的一部分而产生；(2)fab’，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，以产生完整的轻链和重链的一部分而获得；每个抗体分子获得两个fab’片段；(3)(fab’)2，抗体的片段，可以通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体而不经后续还原而获得；f(ab')2是由两个二硫键保持在一起的两个fab'片段的二聚体；(4)fv，定义为包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(5)单链抗体(“sca”)，包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽接头连接作为基因融合单链分子；和(6)单结构域抗体，由对抗原表现出足够亲和力的单个vh或vl结构域组成。93.在一个具体实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。94.生产多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域公知的(参见，例如harlow和lane,抗体：实验室手册(antibodies:alaboratorymanual),冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory，纽约，1988，通过引用并入本文和随后的实施例部分)。95.根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中表达编码该片段的dna来制备。抗体片段可以按照常规方法，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶对抗体进行酶切来产生，以提供表示为f(ab')2的5s片段。可以使用硫醇还原剂和任选的由二硫键裂解产生的巯基的封端基团进一步裂解该片段，产生3.5sfab'单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价fab'片段和fc片段。这些方法描述于例如如下文献：goldenberg的美国专利us4,036,945和us4,331,647，以及其中包含的参考文献，这些专利在此全文引入作为参考。还参见porter,r.r.，[生物化学(biochem).j.73:119-126(1959)]。也可使用切割抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其它酶、化学或遗传技术，只要片段与完整抗体识别的抗原结合。[0096]fv片段包含vh和vl链的结合。这种结合可以是非共价的，如inbar等人[美国国家科学院学报(proc.nat'lacad.sci.usa)69:2659-62(19720)]。可替代地，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质如戊二醛交联。优选地，fv片段包含通过肽接头连接的vh和vl链。这些单链抗原结合蛋白(single-chainantigenbindingproteins，sfv)是通过构建包含编码由寡核苷酸连接的vh和vl结构域的dna序列的结构基因来制备的。将结构基因插入到表达载体中，随后将其引入到宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成具有桥接两个v结构域的连接体肽的单个多肽链。用于产生sfv的方法描述于例如如下文献：whitlow和filpula，方法(methods)2:97-105(1991)；bird等人，科学(science)242:423-426(1988)；pack等人，生物科技(bio/technology)11:1271-77(1993)；和美国专利us4,946,778，其全部内容通过引用并入本文。[0097]抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(complementarity-determiningregion，cdr)的肽。可以通过构建编码感兴趣抗体的cdr的基因来获得cdr肽(“最小识别单位(minimalrecognitionunits)”)。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的rna合成可变区来制备这种基因。参见，例如，larrick和fry，[方法(methods)2:106-10(1991)]。[0098]非人类(例如鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2)或抗体的其它抗原结合序列的嵌合分子，其含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体互补决定区(cdr)的残基被来自非人类物种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基取代，所述非人类物种具有所需的特异性、亲和力和能力(capacity)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体也可以包含既不存在于受体抗体也不存在于输入的cdr或构架序列中的残基。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常两个可变区，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人类免疫球蛋白的cdr区，并且所有或基本上所有的fr区是人类免疫球蛋白共有序列的那些fr区。人源化抗体最优地还将包含免疫球蛋白恒定区(immunoglobulinconstantregion，fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区(fc)的至少一部分[jones等人，自然(nature)，321:522-525(1986)；riechmann等人，自然(nature)，332:323-329(1988)；和presta，结构生物学新观点(curr.op.struct.biol.),2:593-596(1992)]。[0099]人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为输入残基(importresidues)，其通常取自输入可变结构域。人源化基本上可以按照winter和其同事的方法进行[jones等人，自然(nature)，321:522-525(1986)；riechmann等人，自然(nature)332:323-327(1988)；verhoeyen等人，科学(science)，239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿类cdr或cdr序列取代人类抗体的相应序列。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体(美国专利us5,189,047)，其中基本上少于完整的人可变区已经被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些fr残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。[0100]人类抗体也可以使用本领域已知的各种技术生产，包括噬菌体展示文库(phagedisplaylibraries)[hoogenboom和winter,分子生物学杂志(j.mol.biol.),227:381(1991)；marks等人，分子生物学杂志(j.mol.biol.),222:581(1991)]。cole等人和boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体[cole等人，单克隆抗体和癌症(monoclonalantibodiesandcancertherapy)，alanr.liss出版社77页(1985)，和boerner等人，免疫学杂志(j.immunol.),147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠，来制备人类抗体。攻击后，观察到人抗体的产生，其在所有方面都与在人类中观察到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。该方法描述于例如如下文献：美国专利us5,545,807；us5,545,806；us5,569,825；5,625,126；us5,633,425；us5,661,016，和在以下科学出版物：marks等人，生物科技(bio/technology)10:779-783(1992)；lonberg等人，自然(nature)368:856-859(1994)；morrison,自然(nature)368812-13(1994)；fishwild等人，自然生物技术(naturebiotechnology)14,845-51(1996)；neuberger,自然生物技术(naturebiotechnology)14:826(1996)；和lonberg和huszar,免疫学(intern.rev.immunol.)13,65-93(1995)。[0101]trem-2抑制剂抗体的示例公开于wo2017/058866和申请号为20190010230的美国专利申请，其内容通过引用公开于本文中。[0102]其它示例性trem-2抑制剂抗体公开于申请号为20200017584的美国专利申请和申请号为20190336615的美国专利申请。[0103]trem-2抑制剂抗体的示例是具有seqidno:51的cdr-h1、seqidno:52的cdr-h2、seqidno:53的cdr-h3、seqidno:54的cdr-l1、seqidno:55的cdr-l2和seqidno:56的cdr-l1的抗体。[0104]本发明人考虑的其它trem-2抗体包括可从r&d商购的那些抗体，包括baf1828(人类)、mab17291(人类和小鼠)、af1828(人类)和af1729(小鼠)。[0105]根据一个具体实施方式，降低gpnmb的量和/或活性的试剂是抑制剂抗体，在本文中也称为拮抗剂抗体。[0106]gpnmb抑制性抗体的示例公开于申请号为20180043014的美国专利申请中，其内容通过引用公开于本文中。[0107]示例性的人类抗-gpnmb抗体包括mab1.10.2、mab1.15.1、mab1.2.2、mab1.7.1、mab2.10.2、mab2.15.1、mab2.16.1、mab2.17.1。这些抗体具有在本技术中鉴定的氨基酸序列和编码其核酸序列，如表1和2所示。[0108][0109]本文所述的抗体(双特异性或单特异性)可以与细胞毒性剂结合。[0110]如本文所用，术语“细胞毒性剂(cytotoxicagent)”是指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，211at、131i、125i、32p、35s和lu的放射性同位素，包括177lu、86y、90y、111in、177lu、225ac、212bi、213bi、66ga、67ga、68ga、64cu、67cu、71as、72as、76as、77as、65zn、48v、203pb、209pb、212pb、166ho、149pm、153sm、201tl、188re、186re和99mtc)，如本文另外描述的抗癌剂，包括化学剂(抗癌药物，例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷))、紫杉醇、阿霉素(doxoruicin)、顺铂、5-氟尿苷、美法仑、溴化乙锭、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素和其它嵌入剂、酶及其片段，例如核裂解酶、抗生素、rna分子(例如sirna、反义寡核苷酸、微小rna(microrna)、核酶、rna诱饵、适体)、dna酶、抗体、蛋白质和编码其的多核苷酸，以及毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，例如商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein，pap)、蓖麻毒素a、相思豆毒素、白树毒素(gelonin)、肥皂草素(saporin)、毒素a(choleratoxina)、白喉类毒素、假单胞菌外毒素和八叠球菌素(alpha-sarcin)，包括其片段和/或变体。[0111]应当理解，本发明的试剂(例如，抗体)本身可以施用于主体，或者施用于与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中。[0112]本文所用的“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指一种或多种本文所述的活性成分与其它化学组分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。[0113]本文中，术语“活性成分(activeingredient)”是指本发明的试剂(例如，抗体)，其可解释生物效应。[0114]下文中，短语“生理学上可接受的载体(physiologicallyacceptablecarrier)”和“药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”可互换使用，是指不会对生物体造成明显刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂。[0115]本文中，术语“赋形剂(excipient)”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的非限制性示例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。[0116]药物的配制和给药技术可以在以下文献中到：“雷明登氏药学全书(remington'spharmaceuticalsciences)”，麦克出版公司(mackpublishingco.),宾夕法尼亚州伊斯顿，最新版本，其通过引用并入本文。[0117]合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、神经外科策略(例如，脑内注射、纹状体内输注或脑室内输注、脊髓内、硬膜外)、经粘膜、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。[0118]可替代地，可以以局部方式而不是全身方式施用药物组合物，例如通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域(例如脂肪组织)中。[0119]根据一个优选实施方式，所述试剂不施用到主体的脑中。[0120]本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣片制造(dragee-making)、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。[0121]因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选的给药途径。[0122]对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液中配制，例如汉克氏液(hank’ssolution)、林格氏液(ringer’ssolution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。[0123]对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这种载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄取。口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。[0124]糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料(dyestuffs)或颜料(pigments)添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。[0125]可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂应为适于所选给药途径的剂量。[0126]对于口腔给药(buccaladministration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。[0127]对于通过鼻吸入给药，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，将根据本发明使用的活性成分，方便地以气溶胶喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀来确定。用于分配器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。[0128]本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。[0129]肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。[0130]可选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高浓度的溶液。[0131]可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液一起配制。[0132]本发明的药物组合物还可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。[0133]适用于本发明上下文的药物组合物包括这样的组合物，其中含有有效量的活性成分以实现预期目的(例如减少脂肪细胞的数量或大小，或减少内脏脂肪的量)。[0134]有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容确定。[0135]对于在本发明方法中使用的任何制剂，有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定(cellcultureassays)中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现所需的浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定人类的有用剂量。[0136]本文所述的活性成分的毒性和功效可通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。具体的制剂、给药途径和剂量可以由单独的医师根据患者的状况来选择。(参见，例如，fingl等人，1975，学的药理基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)，ch.1p.1)。[0137]可以单独调节剂量和间隔，以提供足以减少脂肪细胞的数量或大小或减少内脏脂肪的活性成分的组织水平(最小有效浓度(minimaleffectiveconcentration)，mec)。每种制剂的mec会有所不同，但是可以根据体外数据进行估计。达到mec所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定(detectionassays)可用于确定血浆浓度。[0138]根据待病症的严重性和反应性，给药可以是单次或多次给药，过程持续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。[0139]当然，组合物的给药量将取决于所的主体、病痛的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。[0140]如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如fda批准的试剂盒，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器也可以由与容器相关的通知，以由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式来容纳，该通知反映了该机构对用于人类或兽医给药的组合物形式的批准。此类通知例如可以是美国食品药品管理局批准的处方药物的标签或批准的产品插页。还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于指定的病症，如上文进一步详述的。[0141]本发明人考虑向主体(与上述靶向trem-2/gpnmb表达细胞的试剂组合)施用另外的化疗剂(chemotherapeuticagents)。此类试剂可与上述用于癌症的试剂协同作用。[0142]可以与本领域已知的任何抗癌组合，包括但不限于化疗剂、放疗剂(radiotherapeuticagents)、激素疗法(hormonaltherapy)、免疫调节剂(immunemodulators)、工程免疫细胞疗法(engineeredimmunecelltherapy)(例如car-t)和本领域熟知的其它方案(例如手术、细胞移植，例如造血干细胞移植)。[0143]本发明的化疗剂可以是但不限于阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、ara-c、cytosar-u)；阿司匹林；舒林酸；姜黄素；烷化剂，包括：氮芥类(nitrogenmustards)，例如二氯甲基二乙胺(mechlor-ethamine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine，bcnu)、洛莫司汀(lomustine，ccnu)和司莫司汀(semustine)(甲基-ccnu)；乙烯亚胺(thylenimines)/甲基三聚氰胺(methylmelamine)，例如三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine，tem)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)(hmm、六甲蜜胺(altretamine))；烷基磺酸盐(alkylsulfonates)，例如白消安；三嗪类(triazines)，例如达卡巴嗪(dacarbazine，dtic)；抗代谢物(antimetabolites)，包括叶酸类似物如甲氨蝶呤和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)(arac、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮杂胞苷、2,2-二氟脱氧胞苷(2,2·difluorodeoxycytidine)，嘌呤类似物如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧助间型霉素(2'-deoxycoformycin)(喷司他汀(pentostatin))、赤羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，ehna)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)和2-氯脱氧腺苷(2-chlorodeoxyadenosine)(克拉屈滨(cladribine)、2-cda)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，例如紫杉醇、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(包括长春碱(vinblastine，vlb)、长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine))、泰索帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(epipodophylotoxins)，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如放线菌素d(actimomycind)、柔红霉素(daunomycin)(红比霉素(rubidomycin))、阿霉素(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycins)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、丝裂霉素c和放线菌素；酶如l-天冬酰胺酶；细胞因子如干扰素(tnf)-γ、肿瘤坏死因子(tnf)-α、tnf-β和gm-csf；抗血管生成因子如血管抑制素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)；fgf或vegf的抑制剂如血管生成因子可溶性受体形式，包括可溶性vgf/vegf受体；铂配位络合物(platinumcoordinationcomplexes)如顺铂和卡铂；蒽二酮(anthracenediones)如米托蒽醌(mitoxantrone)；取代的脲如羟基脲；衍生物包括n-(nmethylhydrazine，mih)和甲基苄肼；肾上腺皮质抑制剂如米托坦(mitotane)(o,p'-ddd)和氨基导眠能(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂如泼尼松和等价物，地塞米松和氨鲁米特；孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)和醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇等价物；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等价物；抗雄激素，例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；非甾体抗雄激素(non-steroidalantiandrogens)，例如氟他胺；激酶抑制剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；甲基化抑制剂；蛋白酶体抑制剂；单克隆抗体；氧化剂；抗氧化剂；端粒酶抑制剂；bh3模拟物；泛素连接酶抑制剂；stat抑制剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(商品名为gleevac或glivac)和厄洛替尼(egf受体抑制剂)，商品名为tarveca；以及抗病毒剂(anti-virals)，例如磷酸奥司他韦、两性霉素b和帕利珠单抗。[0144]在一些实施方式中，本发明的化疗剂是阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、ara-c、cytosar-u)、奎扎替尼(quizartinib)(ac220)、索拉非尼(sorafenib)(bay43-9006)、来他替尼(lestaurtinib)(cep-701)、米哚妥林(midostaurin，pkc412)、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥(mechlorethamine)、甲基苄肼、喷司他汀、(2'-脱氧助间型霉素)、依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康(topotecan)、长春碱、长春新碱、紫杉醇、地塞米松、甲基强的松龙(methylprednisolone)、泼尼松(prednisone)、全反式视黄酸(all-transretinoicacid)、、干扰素-α、利妥昔单抗(rituximab)吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin)、甲磺酸伊马替尼、cytosar-u)、美法仑、白消安塞替派、博来霉素、铂(顺铂)、环磷酰胺柔红霉素、阿霉素、伊达比星、米托蒽醌、5-氮杂胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、羟基脲、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、6-硫鸟嘌呤或其任何组合。[0145]根据一个具体实施方式，与免疫检查点抑制剂组合，如下文所述。[0146]如本文所用，“免疫检查点抑制(immunecheckpointinhibition)”是指癌症免疫疗法。该疗法靶向免疫检查点，免疫检查点是免疫系统刺激或抑制其行动的关键调节因素，肿瘤可以利用免疫检查点保护自己免受免疫系统的攻击。检查点可以阻断抑制检查点，激活刺激功能，从而恢复免疫系统功能。目前批准的检查点抑制剂靶向分子ctla4、pd-1和pd-l1。pd-1是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(也称为pdcd1和cd279)，其与pd-l1(pd-1配体1或cd274)相互作用。[0147]免疫检查点抑制剂的示例包括但不限于细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4)、程序性死亡1(pd-1)或其配体、淋巴细胞活化基因-3(lag3)、b7同系物3(b7-h3)、b7同系物4(b7-h4)、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(ido)、腺苷a2a受体、神经突蛋白(neuritin)、b和t淋巴细胞衰减剂(btla)、杀伤免疫球蛋白样受体(kir)、t细胞免疫球蛋白和含有黏蛋白结构域的蛋白3(mucindomain-containingprotein3，tim-3)、诱导型t细胞共刺激剂(inducibletcellcostimulator，icos)、cd27、cd28、cd40、cd244(2b4)、cd160、garp、ox40、cd137(4-1bb)、cd25、vista、btla、tnfr25、cd57、ccr2、ccrs、ccr6、cd39、cd73、cd4、cd18、cd49b、cd1d、cds、cd21、timi、cd19、cd20、cd23、cd24、cd38、cd93、igm,b220(cd45r)、cd317、cd11b、ly6g、icam-1、fap、pdgfr、平足蛋白(podoplanin)和tigit。[0148]临床批准的免疫检查点抑制剂的示例包括但不限于伊匹单抗(抗ctla-4)、纳武单抗(nivolimumab)(抗pd-1)和派姆单抗(pembrolizumab)(抗pd-1)。[0149]根据另一实施方式，所述结合布鲁顿酪氨酸激酶(brutonstyrosinekinase，btk)抑制剂(例如依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡替尼(acalabrutinib)或司培替尼(spebrutinib))。[0150]本发明人还考虑基于表达trem2和gpnmb两者的髓样细胞的存在选择类型。[0151]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种主体的癌症的方法，其包括：[0152](a)分析主体样品中表达trem2和gpnmb两者的髓样细胞的存在；和[0153](b)当所述髓样细胞的量高于预定量时，用有效量的靶向trem2和/或gpnmb的试剂主体；或者当所述细胞的量低于预定量时，用有效量的化疗剂主体，所述化疗剂不同于靶向trem2和/或gpnmb的所述试剂。[0154]确定基因表达谱的方法可以在rna或蛋白质水平上进行。[0155]以下是可用于在单细胞水平上分析多个基因表达的方法的更详细描述。[0156]分析和/或定量rna的方法[0157]印迹(northernblot)分析：该方法包括检测rna混合物中的特定rna。通过用防止碱基对之间氢键结合的试剂(例如甲醛)处理而使rna样品变性，确保所有rna分子具有未折叠的线性构象。然后通过凝胶电泳根据大小分离单个rna分子，并转移到硝化纤维或尼龙基膜上，变性的rna粘附到所述硝化纤维或尼龙基膜上。然后将膜暴露于标记的dna探针。可以使用放射性同位素或酶连接的核苷酸标记探针。检测可以使用放射自显影、比反应或化学发光。该方法允许定量特定rna分子的量，并通过膜上的相对位置来确定其身份(identity)，该相对位置表示电泳过程中凝胶中的迁移距离。[0158]rt-pcr分析：该方法使用相对稀少的rna分子的pcr扩增。首先，从细胞中纯化rna分子，并使用逆转录酶(如mmlv-rt)和引物(如寡dt、随机六聚体或基因特异性引物)将其转化为互补dna(cdna)。然后应用基因特异性引物和taqdna聚合酶，在聚合脢连锁反应器(pcrmachine)中进行pcr扩增反应。本领域技术人员能够选择适于检测特定rna分子的基因特异性引物的长度和序列以及pcr条件(即退火温度、循环次数等)。应当理解，半定量rt-pcr反应可以通过调节pcr循环次数并将扩增产物与已知对照进行比较来使用。[0159]rna原位杂交染：在该方法中，dna或rna探针结合到细胞中存在的rna分子上。通常，首先将细胞固定到显微载玻片上以保持细胞结构并防止rna分子降解，然后用含有标记探针的杂交缓冲液处理。杂交缓冲液包括诸如甲酰胺和盐(例如氯化钠和柠檬酸钠)的试剂，其能够使dna或rna探针与它们的靶mrna分子原位特异性杂交，同时避免探针的非特异性结合。本领域技术人员能够根据特定探针和细胞类型调整杂交条件(即温度、盐和甲酰胺的浓度等)。杂交后，洗去任何未结合的探针，并使用已知的方法检测结合的探针。例如，如果使用放射性标记的探针，则将载玻片置于感光乳剂(photographicemulsion)，该感光乳剂揭示使用放射性标记的探针产生的信号；如果探针用酶标记，则加入酶特异性底物以形成比反应；如果使用荧光标记物标记探针，则使用荧光显微镜显示结合的探针；如果使用标签(tag)(例如高辛配基(digoxigenin)、生物素等)标记探针，则结合的探针可在与标签特异性抗体相互作用后被检测，所述标签特异性抗体可使用已知方法进行检测。[0160]原位rt-pcr染：该方法描述于如下文献：nuovogj等人[聚合酶链反应(intracellularlocalizationofpolymerasechainreaction，pcr)扩增的丙型肝炎cdna的细胞内定位，美国外科病理学杂志(amjsurgpathol.)1993,17:683-90]，和komminothp等人[对档案肝活检中丙型肝炎病毒检测方法的评估。组织学、免疫组织化学、原位杂交、逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和原位rt-pcr的比较。病理研究与实践(patholrespract.)1994,190:1017-25]。简言之，rt-pcr反应是通过将标记的核苷酸掺入pcr反应对固定细胞进行的。使用特定的原位rt-pcr装置进行反应，例如可从arcturusengineering公司(加利福尼亚州，山景(mountainview,ca))获得的激光捕获显微解剖pixcellilcm系统。[0161]单细胞转录组分析[0162]该方法依赖于对单个细胞的转录组进行测序。在一个实施方式中，使用高通量方法，其中来自不同细胞的rna被单独标记，允许创建单个文库，同时保持每次读取的细胞身份(cellidentity)。该方法可以以多种方式执行-参见例如申请号为20100203597的美国专利申请和申请号为20180100201的美国专利申请，其内容通过引用并入本文。[0163]一种进行单细胞转录组分析的特定方法总结如下。[0164]通常将细胞等分到孔中，使得每个孔仅存在一个细胞。用破坏细胞和核膜的试剂处理细胞，使细胞的rna易于进行测序反应。[0165]根据一个实施方式，使用以下体外转录扩增方案扩增rna：[0166](步骤1)在允许从rna合成单链dna分子的条件下，使单细胞的rna与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含在其3'末端的polydt序列，在其5'末端的t7rna聚合酶启动子序列和位于polydt序列和rna聚合酶启动子序列之间的条形码序列，其中所述条形码序列包含细胞条形码和分子标签；[0167]该实施方式的polydt寡核苷酸可以可选地包含测序所需的接头序列(adaptersequence)-参见例如图5。[0168]rna聚合酶启动子序列是本领域已知的，包括例如t7rna聚合酶启动子序列-例如scgattgaggccggtaatacgactcactataggggc(seqidno:57)。[0169]优选地，polydt序列包含至少5个核苷酸。根据另一实施方式，polydt序列介于约5至50个核苷酸之间，更优选介于约5至25个核苷酸之间，甚至更优选介于约12至14个核苷酸之间。[0170]当在一个反应中收集多个样品时，条形码序列在多重反应期间是有用的。条形码序列可用于识别特定的分子、样品或文库。条形码序列连接在polydt序列的5'端和t7rna聚合酶序列的3'端。条形码序列可以介于3至400个核苷酸之间，更优选介于3至200个核苷酸之间，甚至更优选介于3至100个核苷酸之间。因此，条形码序列可以是6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。[0171]在一个实施方式中，条形码序列用于识别细胞类型或细胞源(例如患者)。[0172]分子标签(molecularidentifiers)可用于校正扩增偏差，这降低了该方法的定量准确度。分子标签包含4至20个碱基。分子标签的长度使得样品的每个rna分子都用具有独特序列的分子标签进行编目(标记)。[0173]在引物(例如polydt引物)与rna样品退火之后，rna-dna杂交体的合成可以通过使用rna依赖性dna聚合酶的逆转录来进行。用于本发明方法和组合物的合适的rna依赖性dna聚合酶包括逆转录酶(reversetranscriptases，rts)。rts在本领域中是公知的。rt的示例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，m-mlv)逆转录酶、人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)逆转录酶、禽成髓细胞增多症病毒(avianmyeloblastosisvirus，amv)逆转录酶、劳斯相关病毒(rousassociatedvirus，rav)逆转录酶和成髓细胞瘤相关病毒(myeloblastosisassociatedvirus，mav)逆转录酶或其它禽类肉瘤-白血病病毒(aviansarcoma-leukosisvirus，aslv)逆转录酶，以及由其衍生的修饰的rt。参见例如美国专利us7,056,716。许多逆转录酶，例如来自禽成髓细胞病病毒(avianmyeloblastosisvirus，amv-rt)和莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，mmlv-rt)的逆转录酶，包含一种以上的活性(例如聚合酶活性和核糖核酸酶活性)，并且可以在双链cdna分子的形成中起作用。然而，在一些情况下，优选使用缺乏或具有显著降低的核糖核酸酶h(rnaseh)活性的rt。[0174]缺乏核糖核酸酶h活性的rts在本领域是公知的，包括包含野生型逆转录酶突变的那些rts，其中该突变消除了核糖核酸酶h活性。具有降低的核糖核酸酶h活性的rt的示例描述于us20100203597中。在这些情况下，添加来自其它来源的核糖核酸酶h，例如分离自大肠杆菌的核糖核酸酶h，可以用于形成单链cdna。还考虑了rt的组合，包括不同非突变rt的组合，不同突变rt的组合，以及一种或多种非突变rt与一种或多种突变rt的组合。[0175]合适的酶的示例包括但不限于来自安捷伦公司(agilent)的affinityscript或来自英杰生命技术有限公司(invitrogen)的superscriptiii。优选地，逆转录酶没有末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase，tdt)活性。[0176]在逆转录反应中所需的其它组分包括dntp(datp、dctp、dgtp和dttp)和可选的还原剂如二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)和mncl2。[0177]可将polydt寡核苷酸连接到固体支持物(例如珠粒(beads))上，从而可以纯化合成的cdna。[0178]退火温度和时间由引物预期退火至模板上的效率和容许的错配程度决定。[0179]通常选择退火温度以提供最佳的效率和特异性，通常介于约50℃至约80℃的范围内，通常介于约55℃至约70℃的范围内，更通常介于约60℃至约68℃的范围内。退火条件通常保持在介于约15秒至约30分钟的范围内，通常在介于约30秒至约5分钟的范围内。[0180](步骤2)：一旦产生了cdna，就可以从其它单个细胞产生的cdna中收集cdna(使用与上述相同的方法)。[0181]可以可选地用酶处理样品，以除去过量的引物，例如外切核酸酶i。也考虑了纯化单链dna的其它选择，包括例如使用顺磁性微粒。这可以在样品合并之后或之前进行。[0182](步骤3)：第二链合成。[0183]cdna的第二链合成可以通过在三磷酸核苷酸(nucleotidetriphosphates)和dna聚合酶的存在下孵育样品来实现。市售的试剂盒可用于该步骤，其包括另外的酶如核糖核酸酶h(用于去除rna链)和缓冲液。该反应可以可选地在dna连接酶的存在下进行。第二链合成之后，可以使用本领域已知的方法纯化产物，包括例如使用顺磁性微粒。[0184](步骤4)：在合成cdna的第二链之后，可以通过与相应的rna聚合酶一起孵育来合成rna。可以使用市售的试剂盒，例如t7高产量rna聚合酶ivt试剂盒(t7highyieldrnapolymeraseivtkit)(新英格兰生物学实验室(newenglandbiolabs))。[0185](步骤5)：在扩增的rna片段化之前，可以使用脱氧核糖核酸酶除去dna。rna也可以在片段化之前纯化。rna的片段化可以如本领域已知的那样进行。片段化试剂盒是市售的，例如ambionambionfragmentationkit试剂盒。[0186](步骤6)：扩增和片段化的rna现在在其3'端被标记。为此，进行连接酶反应，该反应基本上将单链dna(singlestrandeddna，ssdna)连接到rna上。标记扩增和片段化的rna的其他方法描述于申请号为20170137806的美国专利申请中，其内容通过引用并入本文。单链dna在其5'末端具有游离的磷酸，可选地在其3'末端具有封闭部分，以防止头尾连接。阻断部分(blockingmoiety)的示例包括c3间隔区或生物素部分。通常，ssdna长度介于10至50个核苷酸之间，更优选介于15至25个核苷酸之间。[0187](步骤7)：然后使用与前述步骤中使用的引物互补的引物进行逆转录。然后可以通过嵌套pcr反应完成和扩增文库，如图5所示。[0188](步骤8)：扩增[0189]一旦本发明的接头多核苷酸(adapterpolynucleotide)与单链dna连接(即进一步延伸单链dna)，就可以进行扩增反应。[0190](步骤9)：测序[0191]序列测定的方法通常是本领域技术人员已知的。优选的测序方法是下一代测序方法或并行高通量测序方法，例如大规模平行测序技术(massivelyparallelsignaturesequencing，mpss)。设想的测序方法的示例是焦磷酸测序(pyrosequencing)，特别是454焦磷酸测序，例如基于roche454基因组测序仪。这种方法在油溶液中的水滴中扩增dna，每个水滴含有一个dna模板，该dna模板连接于一个引物包被的珠粒(bead)，然后所述珠粒形成克隆菌落(clonalcolony)。焦磷酸测序使用萤光素酶产生光来检测加入新生dna的单个核苷酸，组合的数据用于产生序列读数。另一个设想的示例是illumina或solexa测序，例如通cancergenomeswithhigh-throughputlinked-readsequencing)”，自然生物技术(naturebiotechnology)34,303-311；以及公开号为wo2014210353a2的国际专利申请，其各自的所有内容和公开内容通过引用整体并入本文。[0196]检测蛋白质的表达和/或活性的方法[0197]在本发明中一些实施方式的培养物的细胞中表达的蛋白质的表达和/或活性水平可以使用本领域已知的方法进行测定。[0198]酶联免疫吸附测定(elisa)：该方法包括将含有蛋白质底物的样品(例如，固定的细胞或蛋白质溶液)固定到表面，例如微量滴定板的孔中。应用与酶偶联的底物特异性抗体，并使其与底物结合。然后通过使用与抗体偶联的酶的比反应来检测和定量抗体的存在。该方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果在线性响应范围内良好校准，则样品中存在的底物的量与产生的颜的量成比例。通常采用底物标准来提高定量准确性。[0199]蛋白质印迹(westernblot)：该方法包括通过丙烯酰胺凝胶将底物与其它蛋白质分离，然后将底物转移到膜(例如尼龙或pvdf)上。然后通过对底物特异的抗体检测底物的存在，所述抗体又通过抗体结合试剂检测。抗体结合试剂可以是，例如，蛋白a或其它抗体。抗体结合试剂可以是如上所述的放射性标记的或酶连接的。检测可以通过放射自显影、比反应或化学发光进行。该方法允许定量底物的量，并通过膜上的相对位置确定其身份，该相对位置表示电泳期间丙烯酰胺凝胶中的迁移距离。[0200]放射免疫测定(radio-immunoassay，ria)：在一种形式(version)中，该方法涉及用固定在可沉淀载体如琼脂糖珠上的特异性抗体和放射性标记的抗体结合蛋白(例如，用i125标记的蛋白a)沉淀所需的蛋白(即，底物)。沉淀颗粒中的计数数与底物的量成比例。[0201]在ria的替代形式中，使用了标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。加入不同量的含有未知量底物的样品。来自标记的底物的沉淀计数的减少与加入的样品中底物的量成比例。[0202]荧光激活细胞分选(荧光活化细胞分选系统，facs)：该方法涉及通过底物特异性抗体在细胞中原位检测底物。底物特异性抗体与荧光团连接。检测是通过细胞分选机(cellsortingmachine)进行的，当细胞通过光束时，该细胞分选机读取每个细胞发出的光的波长。该方法可以同时使用两种或多种抗体。[0203]免疫组化分析(immunohistochemicalanalysis)：该方法包括通过底物特异性抗体在固定细胞中原位检测底物。底物特异性抗体可以酶连接或连接至荧光团。检测是通过显微镜和主观或自动评估进行的。如果使用酶联抗体，则可能需要比反应。应当理解，免疫组织化学(immunohistochemistry)之后通常使用例如苏木精(hematoxyline)或姬姆素染料(giemsastain)对细胞核进行复染。[0204]原位活性测定(insituactivityassay)：根据该方法，将生底物(chromogenicsubstrate)施加到含有活性酶的细胞上，并且该酶催化反应，在该反应中底物被分解，以产生可通过光或荧光显微镜观察到的生产物。[0205]体外活性测定(invitroactivityassays)：在这些方法中，在从细胞中提取的蛋白质混合物中测量特定酶的活性。活性可以在分光光度计孔中使用比法及进行测量，或者可以在非变性丙烯酰胺凝胶(即活性凝胶)中进行测量。电泳后，将凝胶浸泡在含有底manualseries)”，1-4卷，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，纽约(1998)；如以下专利中的方法：美国专利us4,666,828；us4,683,202；us4,801,531；us5,192,659和us5,272,057；细胞生物学：实验室手册(cellbiology:alaboratoryhandbook)，i-iii卷，cellis,j.e.编辑(1994)；freshney的“动物细胞的培养-基本技术手册(cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique)”，wiley-liss公司,n.y.(1994)，第三版；“免疫学实验室手册(currentprotocolsinimmunology)”，i-iii卷coliganj.e.编辑(1994)；stites等人(编辑)，“基础和临床免疫学(basicandclinicalimmunology)”(第8版)，appleton&lange公司，诺瓦克ct(1994)；mishell和shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的选择方法(selectedmethodsincellularimmunology)”，w.h.freemanandco.公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有广泛的描述，参见，例如，美国专利us3,791,932；us3,839,153；us3,850,752；us3,850,578；us3,853,987；us3,867,517；us3,879,262；us3,901,654；us3,935,074；us3,984,533；us3,996,345；us4,034,074；us4,098,876；us4,879,219；us5,011,771和us5,281,521；“寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)”，m.j.编辑(1984)；“核酸杂交(nucleicacidhybridization)”，hames,b.d.和higginss.j.编辑(1985)；“转录和翻译(transcriptionandtranslation)”，hames,b.d.和higginss.j.编辑(1984)；“动物细胞培养(animalcellculture)”，freshney,r.i.编辑(1986)；“固定化细胞和酶(immobilizedcellsandenzymes)”，irl出版社(1986)；“分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”，perbal,b.，(1984)和“酶学方法(methodsinenzymology)”，1-317卷，美国学术出版社(academicpress)；“pcr协议：方法和应用指南(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)”，美国学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州(sandiego,ca)(1990)；marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual)”cshl出版社(1996)；所有这些都通过引用并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在本文中提供了其它一般的参考文献。其中的程序被认为是本领域公知的，是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。[0217]材料和方法[0218]ins-seq固定和细胞内染方案：[0219]1-细胞表面染：将分别来自体外和体内实验的细胞或组织解离成单细胞悬浮液，并用10ml冷pbs洗涤。将细胞在冰冷的洗涤缓冲液(-/-杜氏磷酸缓冲液(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)(biologicalindustries公司)),0.5％bsa(安倍医疗公司(mp-biomedicals)),2mmedta(默克公司(merck))中，用荧光团缀合的抗体(最终浓度为5μg/ml)在冰浴中避光染30分钟。[0220]2-ins-seq固定：在10ml洗涤缓冲液中洗涤表面染的细胞，并以400g离心5分钟。将细胞沉淀(1×10-6至5×10-6个细胞)再悬浮于1体积(100μl)的冷pbs(0.4u/μl+核糖核酸酶抑制剂(普洛麦格公司(promega))中。将细胞悬浮液用9体积(900μl)冷的100％甲醇(bio-lab公司)(预冷至-20℃)在冰浴中避光固定10分钟。为了避免细胞聚集，滴加甲醇，同时轻轻涡旋细胞悬浮液。[0221]固定后立即将固定的细胞以900g沉淀3分钟。完全弃去甲醇-pbs溶液。将细胞沉淀用冰冷的pbs(0.4u/μl+核糖核酸酶抑制剂)洗涤(不重悬浮)两次，而不破坏沉淀，以完全除去甲醇残留物。将细胞沉淀重悬浮于100μl含有硫酸铵溶液(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))、0.05medta(sigma公司)、0.8u/μl+核糖核酸酶抑制剂(ph为5.2)的酶阻断缓冲液(enzymeblockingbuffer)中，并在冰浴中避光保持10分钟。[0222]3-细胞内染：为了洗涤酶阻断缓冲液，加入1ml洗涤缓冲液(0.4u/μl+核糖核酸酶抑制剂)，然后将细胞以900g沉淀3分钟。为了完全除去酶阻断缓冲液，将细胞沉淀用冰冷的洗涤缓冲液(0.4u/μl+核糖核酸酶抑制剂)洗涤两次，而不重悬浮。然后将细胞沉淀在避光条件下与100μl细胞内染缓冲液(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)(biologicalindustries公司))、0.5％bsa(安倍医疗公司(mp-biomedicals))、2medta(sigma公司)和所需细胞内抗体一起孵育20分钟。在孵育结束时，将1ml洗涤缓冲液(0.4u/μl+核糖核酸酶抑制剂)添加到100μl细胞内染缓冲液的顶部，将细胞以900g沉淀3分钟。将细胞沉淀重悬于1ml保存缓冲液中，用70μm尼龙网过滤，并保持在冰浴中，直到细胞分选。[0223]固定和细胞内染方法[0224]1-细胞表面染：将分别来自体外和体内实验的细胞或组织解离成单细胞悬浮液，并用10ml冷pbs洗涤。将细胞在冰冷的洗涤缓冲液(-/-杜氏磷酸缓冲液(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)(biologicalindustries公司))、0.5％bsa(安倍医疗公司(mp-biomedicals))、2mmedta(默克公司(merck))中用荧光团缀合的抗体(最终浓度为5μg/ml)在冰浴中避光染30分钟。[0225]2-固定方法：基于甲醇的细胞固定方案：出自(alles等人，2017)。在10ml洗涤缓冲液中洗涤表面染的细胞，并以400g离心5分钟。在常规微量离心管中处理细胞，以使细胞损失最小化，并始终保持低温。将细胞重悬于100μl冰冷的pbs中。为了避免细胞聚集，滴加8体积(800μl)的甲醇(预冷至-20℃)，同时轻轻混合或涡旋细胞悬浮液(最终浓度：90％甲醇的pbs溶液)。甲醇固定的细胞在冰浴中保持最少15分钟。对于再水合(rehydration)，将细胞以900g沉淀4分钟，在pbs(0.01％bsa，1u/μl+核糖核酸酶抑制剂)中再水合、沉淀、离心、再次重悬浮于pbs(0.01％bsa，1u/μl+核糖核酸酶抑制剂)中，并用70μm尼龙网过滤，并保持在冰浴中，直到细胞分选。[0226]pfa基表面染的细胞(surface-strainedcells)在10ml洗涤缓冲液中洗涤，并以400g离心5分钟。真核转录因子缓冲液套(true-nucleartranscriptionfactorbufferset)市售的试剂盒是根据公开的方案进行的。用70μm尼龙网过滤细胞，并保持在冰浴中，直到细胞分选。[0227]dsp基细胞固定方案：出自(gerlach等人，2019)。在10ml洗涤缓冲液中洗涤表面染(surface-srainedcells)的细胞，并以400g离心5分钟。使用dmso中的2.5mmdsp(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))和2.5mmspdp(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))的组合在200mm磷酸钠缓冲盐水(ph8.4)和150mmnacl(sigma公司)中固定细胞45分钟。在用100mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl，ph7.5)、150mmnacl进行固定淬灭之后，使用pbs中的0.5x无蛋白封闭缓冲液(0.5xproteinfreeblockingbuffer)(pfbb，赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))、0.5u/μl+核糖核酸酶抑制剂、0.1％tritonx100封闭和透化细胞。接着，用pbs中的0.5xpfbb对细胞进行染过夜，其中，pbs中含有2u/μl+核糖核酸酶抑制剂、0.1％triton和250ng/μl所需细胞内抗体。染后，用pbs中的10ml0.1xpfbb轻轻洗涤细胞6次，用70μm尼龙网过滤，并保持在冰浴中，直到细胞分选。[0228]小鼠(mice)[0229]野生型(wild-type，wt)小鼠(c57b1/6)购自harlan公司，并饲养在魏兹曼研究所(weizmanninstitute)动物设施中。trem2-/-敲除(knock-out，ko)小鼠由由marcocolonna教授(turnbull等人，2006)惠赠。foxp3rfp(tg(foxp3-rfp,-cre))小鼠由jakubabramsaon教授惠赠。阿布拉姆桑。给小鼠随意提供食物和水，并在严格的12hr光-暗循环(light-darkcycle)下饲养。给小鼠任意提供食物和水，并在严格的12小时光-暗循环下饲养。所有的实验程序都由机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee，iacuc)。[0230]骨髓来源细胞培养[0231]通过颈椎脱位杀死雌性小鼠。为了分离骨髓，从一条腿中取出股骨和胫骨，从肉中清洗，并使用g21针头注射器用c10培养基(rpmi-1640补充有15％血清、1％×100非必需氨基酸、10mmhepes缓冲液、1mm丙酮酸钠、2mml-谷氨酰胺和50μmβ-巯基乙醇的rpmi-1640)冲洗。通过70μm细胞滤器过滤冲洗的骨髓，并在冷离心机中以300xg离心5分钟。将细胞重悬浮在每条腿250μlrbc裂解溶液(sigma公司)中，并在室温下孵育5分钟，洗涤，并再悬浮于预热的c10培养基中。通过在100mm非组织培养板中铺板补充有20ng/mlgm-csf的10mlc10中的2×106个细胞设置培养物，并在标准培养条件(37℃,5％co2)下孵育(第0天)。在第2天，加入补充有20ng/mlgm-csf的另外10mlc10培养基。在第5天，用补充有20ng/mlgm-csf的新鲜c10培养基替换四分之三的培养基。在第7天，另加入5ml补充有10ng/mlgm-csf的c10培养基。在第8天，通过温和洗涤收集培养物上清液中的非粘附和松散粘附的细胞，并在新的非组织培养板中在补充有10ng/mlgm-csf的新鲜c10培养基中再培养，并用作所有bmdc实验的起始材料。[0232]肿瘤细胞系[0233]mca-205纤维肉瘤细胞系由英国伦敦伦敦大学学院癌症研究所(uclcancerinstitute,london,uk)sergioquezada小组提供。在补充有10％热灭活fbs、1mm丙酮酸钠、2mm1-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))的dmem(41965-039)培养基中培养细胞。在37℃下，在具有潮湿空气和5％co2的培养箱中培养细胞，在100mm组织培养板中培养细胞。使用支原体特异性16srrna基因区域(ezpcr支原体试剂盒；biologicalindustries公司)的引物验证细胞系没有支原体感染。[0234]肿瘤生长测量[0235]用悬浮在100微升pbs中的5×105mca-205细胞皮内(i.d.)接种小鼠的右侧翼。在第19天，使用卡尺测量肿瘤体积。通过测量两个直径并使用公式x2×y×0.52(其中x为较小直径，y为较大直径)计算肿瘤体积。[0236]肿瘤浸润性白细胞的分离[0237]在肿瘤细胞接种后10天和19天杀死携带肿瘤的小鼠。肿瘤在37℃下及进行15分钟的机械(gentlemacstmc管，miltenyibiotecinc.公司，加州圣地亚哥(sandiego，ca))和酶消化(在rpmi-1640中，0.1mg/mli型脱氧核糖核酸酶(dnasetypei)(罗氏公司(roche))，和1mg/ml胶原酶iv(worthington公司))。然后通过100μm细胞滤器(cellstrainer)过滤细胞，用冰冷的分选缓冲液洗涤，离心(5分钟，4℃，300g)，并用荧光团缀合的抗体染。[0238]健康供体的人外周血和外周血pbmc的分离[0239]血液取自3名健康的外周血供血者。外周血采集样品是(0220-15-tlv)批准的一部分。通过密度离心培养基(淋巴细胞分离液(ficoll-paque)(ge医疗生命科学部(gehealthcarelifesciences)))以1:1的比例进行无菌密度梯度分离，从新鲜血液样品中纯化pbmcs。在10℃下进行离心(460g，25min)，小心地吸出单核细胞，并用冰冷的facs缓冲液洗涤，然后在4℃下血红细胞裂解(西格玛奥瑞奇公司(sigma-aldrich))5min，并用冰冷的facs缓冲液洗涤。[0240]从小鼠肿瘤和颈淋巴结中分离t-调节细胞[0241]cd45+、tcr-β+、cd11b-和foxp3+(通过内源性foxp3-rfp或抗foxp3-apc缀合的抗体)细胞从foxp3rfp小鼠的颈淋巴结或mca-205纤维肉瘤肿瘤(fiborosarcomatumors)中分离出来。[0242]mars-seq2.0的流式细胞术分选[0243]染后，将细胞洗涤并重悬于冷洗涤缓冲液(pbs中的0.5％bsa和2mmedta)中，用荧光团缀合的抗小鼠cd45抗体染，并通过70μm滤器(strainer)过滤。在分选之前，细胞用碘化丙啶染，以排除死亡/濒死细胞。使用bdfacsariafusion流式细胞仪(bd生物科学公司(bdbiosciences))进行细胞分选，在排除死亡细胞和双联细胞(doublets)后对cd45+细胞进行门控(gating)。如上所述(keren-shaul等人，2019)，将单细胞分选到含有2ml裂解溶液和用于scrna-seq的带条形码的聚(t)逆转录(rt)引物的384-孔捕获板中。分选后，立即旋转平板以确保细胞浸入裂解溶液中，在干冰上速冻并储存在80℃下，直至进一步处理。使用bdfacsdiva软件(bd生物科学公司(bdbiosciences))和flowjo软件(flowjo,llc公司)分析细胞。[0244]质谱流式细胞技术(cytof)[0245]如前所述处理小鼠肿瘤样品以获得单细胞悬浮液。使用cd45微珠(miltenyibiotech公司)富集肿瘤浸润性免疫细胞。用cytofpbs洗涤细胞，并用顺铂活力染剂(cisplatinviabilitystain)染1分钟，洗涤两次，并在室温下用细胞外抗体混合物染30分钟。在细胞外染之后，将细胞洗涤两次，并使用cytof核抗原染缓冲液工作溶液[用核抗原染缓冲液稀释剂(3份)稀释4x核抗原染缓冲液浓缩物(1份)]固定30分钟，同时每10分钟移液一次。通过使用cytofperm-s缓冲液对固定的细胞进行处理，并用细胞内抗体混合物染30分钟。将固定的细胞洗涤两次，并重悬于4％甲醛(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))中，并在4℃保存过夜，直至采集日。[0246]使用cytof3(helios公司)系统(fluidigm)分析染和固定的细胞。使用cytobank处理数据。[0247]用于qpcr实验的流式细胞仪体细胞(bulkcell)分选：[0248]使用bdfacsaria融合流式细胞仪(bd生物科学公司(bdbiosciences))分选细胞。在分选之前，将所有样品通过70μm尼龙网过滤。样品是cd11b+、(gpnmb+/pdpn+/lyc6+)或(cd11c+mhcii高(high)/中(mid))。将5,000至10,000个细胞分选到含有40μl裂解/结合缓冲液(英杰生命技术有限公司(invitrogen))的低结合离心管(low-bindeppendorftube)中。分选后，立即旋转试管以确保细胞浸入裂解溶液中，在干冰上快速冷冻，并在-80℃下储存，直至处理。[0249]用于基因富集验证的rt-qpcr：[0250]用12μl的dynabeadsoligo(dt)(英杰生命技术有限公司(invitrogen))捕获分选到裂解/结合缓冲液中的细胞的mrna，洗涤，并在85℃下用10μl的10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-cl)(ph7.5)洗脱。使用逆转录酶(superscriptii)(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))逆转录mrna，并使用不同的基因引物以1:40稀释cdna，用于qpcr测量(参见表3)。[0251]表3[0252][0253][0254]基于液滴的scrna-seq(10x铬(10xchromium))[0255]新鲜或ins-seq固定的细胞(ins-seq-fixedcells)被流式细胞荧光分选技术(facs)分别分选到0.04％pbs-bsa缓冲液或ins-seq收集缓冲液中。细胞用台盼蓝(trypanblue)进行染，并使用光学显微镜计数，然后根据制造商的使用说明将其加载到10x铬微流体系统(10xchromiummicrofluidicssystem)上。根据10x单细胞5'v2方案指南(10xsinglecell5’v2protocolguidelines)，使用10x基因组学铬单细胞5'试剂盒v2(10xgenomicschromiumsinglecell5'kitv2)和10x铬控制器(10xchromiumcontroller)(10xgenomics公司)产生scrna-seq5'基因表达(geneexpression，gex)文库。使用75个成对末端读数，用illumina'snextseq500对5’mrna文库进行测序。[0256]mars-seq2.0文库制剂[0257]如前所述制备单细胞文库(keren-shaul等人，2019)。简言之，将来自分选到细胞捕获板中的细胞的mrna条形码化，转化成cdna，并使用自动化管道将其汇集。然后通过t7体外转录将合并的样品线性扩增，通过在连接、rt和pcr过程中用文库条形码和illumine序列标记样品，将所得rna片段化，并转化为可用于测序的文库。如前所述，测试每个细胞池的文库质量，并评估浓度。总的来说，条形码是在三个层次上完成的：细胞条形码，允许将读取的每个序列归于其起源的细胞，从而实现汇集；唯一分子标签(uniquemolecularidentifiers，umis)允许标记每个原始分子，以避免扩增偏差；以及平板条形码，允许消除批量效应。[0258]使用rt-qpcr的固定方法之间的mrna质量比较：[0259]根据包括ins-seq(如上所述)在内的不同固定方案指南(protocolguideline)固定第9天培养bmdc，并对cd11c染。将来自每个方案的5000个细胞直接分选到40μl裂解结合缓冲液(英杰生命技术有限公司(invitrogen))中。根据方案用12μldynabeadsoligo(dt)(英杰生命技术有限公司(invitrogen))捕获mrna。仅对于dsp样品，通过与6mmdntp、150mmtrisph8、90mmdtt、0.1％triton、6u/μlrnasinplus在25℃孵育45分钟，接着在65℃孵育5分钟，然后冷却至4℃，使mrna反向交联。对于所有固定方案，在相同反应(rt-pcr)中，将每一半的mrna材料逆转录或反向转录(reversetranscribed)并扩增(14个循环)。将cdna或扩增的cdna稀释(1:40)，并用小鼠actb引物在qpcr中定量。[0260]抑制测定：[0261]从11周wt雌性(c57b1/6)小鼠中分离出脾脏，并将其解离成单细胞悬浮液，并通过70mm细胞过滤器过滤。用rbc裂解缓冲液(sigma公司)裂解红细胞。脾细胞通过cd8t细胞富集ls柱(miltenyi公司)。根据制造商的使用说明，用cellproliferationdyeefluortm450(英杰生命技术有限公司(invitrogen))标记富集的cd8t细胞，并分别以1:1的比例与无菌分选的肿瘤内(mca205)cd11b+gpnmb+或cd11b+cxc3r1+或cd11b+ccr2+细胞共培养。然后根据试剂盒使用说明，用cd3/cd28dynabeads(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))活化t细胞。在含有重组il-2(5ng/ml)和100u/ml青霉素/链霉素的c10培养基中的tc96孔板圆底(conring公司)中在共培养细胞。作为对照，在有或没有活化的情况下单独地培养t细胞。72小时后收集细胞，用cd8-apc/cy7对细胞悬液染，以仅门控t细胞，并通过cellproliferationdyeefluortm450稀释在facs分析中测量t细胞增殖。[0262]单细胞rna测序分析[0263]单细胞rna数据处理(10x)[0264]使用cellrangersinglesoftwaresuitev.3.1.0进行样品比对，使用默认参数进行多路解复用(de-multiplexing)和umi计数。总共收集了82,223个由17个样品(5个新鲜样品和12个ins-seq样品)组成的单细胞，每个样品回收的细胞数介于343至9507的范围内。每个细胞的平均读数从13,480到353,472不等，每个细胞的中值umi为561至8092。如果表达的基因的数目小于300，则丢弃低质量的细胞。如果细胞的线粒体基因表达大于10％，则细胞也被除去。[0265]铬(10x)数据集成和聚类分析[0266]对于新鲜和ins-seqscrna-seq数据的处理，我们使用seuratr软件包3.0版本(seuratrpackageversion3.0)。首先，我们对细胞进行过滤，去除基因表达少于300或线粒体基因表达比例高于总umis10％的细胞。接下来，使用normalizedata函数对成对的新鲜和ins-seq样品的数据进行归一化，并使用findintegrationanchors函数对跨越数据集的方法效果进行校正。我们使用umap算法进行louvain聚类和降维。已经使用findallmarkers功能和wilcoxon试验鉴定了每个簇的标记基因。[0267]mars-seq处理[0268]在illuminanextseq500上，以每细胞约40,000个读数的中值测序深度对scrna-seq文库(以等摩尔浓度汇集)进行测序。将序列映射(mappedto)至小鼠(mm10)。如前所述，进行多路解复用和过滤，并进行如下修改：使用hisat(版本0.1.6)进行读数映射；排除具有多个映射位置的读数。使用ensembl基因注释数据库(embl90版)，如果读数被映射到外显子，则将读数与基因相关联。在同一条链上共享基因组位置的不同基因的外显子被认为是具有串联基因符号的单个基因。通过对空的mars-seq井(wells)进行统计，估计数据中的虚假的唯一分子标签(umis)水平，并排除估计噪声》5％的罕见病例(所有实验的中值估计噪声为2％)。[0269]元细胞(metacell)分析[0270]我们使用r包“元细胞(metacell)”来分析图4和图5的数据。我们去除了特定的线粒体基因、免疫球蛋白基因和与支持不良的转录模型(用前缀“rp‑”注释)连接的基因。然后我们过滤了小于400umls的细胞。使用参数tvm＝0.3和最小总umi计数》50来选择基因特征。我们随后对那些基因之间的相关矩阵进行了分级聚类(过滤覆盖率低的基因，并使用下采样umi矩阵计算相关性)，并选择了包含锚定基因的基因簇。我们使用k＝100,750自举迭代(bootstrapiterations)和其它标准参数。通过应用已知细胞类型标记基因(例如，ear2、cx3cr1、arg1、trem2、cd3d、cd79b等)的直接分析来注释元细胞。图5中的单核细胞和巨噬细胞的亚组是通过混淆矩阵的层次聚类(hierarchicalclustering)和同质组元细胞中富集基因的监督分析获得的。[0271]结果[0272]ins-seq：一种用于scrna-seq和细胞内蛋白质测量的集成技术。[0273]为了集成细胞内信号传导状态和细胞转录谱，我们开发了ins-seq，一种用于细胞内蛋白免疫检测的集成技术(integrativetechnology)，随后是scrna-seq(图1)。在该方案中，使用基于甲醇和硫酸铵溶液的固定剂来固定和透化细胞，改固定剂沉淀蛋白质并抑制酶活性，并能够进行rna保存和免疫细胞内染(star方法)。然后可以用荧光团缀合的抗体对透化细胞进行细胞内标记，并根据它们的细胞内荧光信号强度对facs进行分类，然后使用基于平板或基于微流体的方法对scrna-seq进行分类。[0274]trem2定义了两个肿瘤浸润性抑制髓样细胞[0275]髓样细胞在控制免疫激活和抑制中起关键作用。然而，迄今为止，除了宽谱系标记物(broadlineagemarkers)(cd11b，gr-1)之外，还没有明确的细胞表面分子来定义骨髓抑制细胞-限制该重要谱系的分子和功能表征。精氨酸1(arginase1，arg1)酶(其将精氨酸代谢成尿素和鸟氨酸)支持许多生理过程，例如肝功能和胶原蛋白的生成(caldwell等人，2018)。在免疫区室内，抑制性髓样细胞激活arg1途径，剥夺了精氨酸的微环境，精氨酸是t细胞活性的必需氨基酸(bronte等人，2018)。arg1与其他代谢蛋白一起，是病理条件下积累的肿瘤相关髓系抑制细胞的标志(gabrilovich，2017；v.kumar等人，2016)为了深入表征tme内的骨髓抑制细胞，应用ins-seq从小鼠肿瘤模型中分离和并分析(profile)了表达arg1的细胞，并定义它们的细胞和分子途径(图2a)。[0276]从mca205荷瘤小鼠(tumor-bearingmice)的肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)中分离出cd45+cd11b+arg1+和cd45+cd11b+arg1-细胞(图4a)。从8,280个qc阳性细胞中除去淋巴细胞、粒细胞和dc细胞，以进行单独分析。基于标记基因表达，将7,648个细胞定义为单核细胞和巨噬细胞。元细胞分析识别了包含6个不同细胞的77个元细胞(图2b-c)。对于每个元细胞，我们基于其在arg1+相对于arg1-细胞中的分数计算arg1富集分数(图2b)。我们发现arg1富集分数与其转录水平之间存在高度相关性(图4b-d)。tme骨髓区以两个主要的arg1阳性细胞为特征；肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage，tam)，以c1qa、spp1、cx3cr1和apoe的表达，以及表达gpnmb、il7r、hilpda、vegfa、hmox1和clec4d，以及其他差异表达基因的调节性髓样细胞(regulatorymyeloidcellpopulation，mreg)来区分(图2b-c)。四个arg1-细胞可以通过特异性标记物的表达来区分：plac8、ly6c2、ccr2、mhc-ii相关基因，以及与i型干扰素信号传导相关的特征(图2b-c)。对arg1+和arg1-元细胞的分析可以重新识别一组丰富的共调节基因模块(图2c)。该分析进一步将髓样细胞2(trem2)上表达的平足蛋白(podoplanin)和触发受体识别为与tam和mreg细胞中arg1表达显著相关的基因(图2c和4c-e)。trem2是一种在多种病理状态下在髓样细胞中被激活的受体(ulland&colonna，2018；zheng等人，2018)，并显示具有增殖和存活功能。此外，trem2被证明是与疾病相关的巨噬细胞(diseaseassociatedmacrophages，dam)(keren-shaul等人，2017)和与脂质相关的巨噬细胞(lipid-associatedmacrophages，lam)(jaitin等人，2019)中调节脂质代谢、吞噬作用和免疫抑制的关键要素。为了验证这些发现，本发明人使用在单细胞数据中识别的表面标记物来富集表达高arg1蛋白的骨髓抑制细胞，然后使用qpcr测量它们的arg1和trem2mrna量。使用靶向pdpn、cx3cr1和gpnmb的抗体，因为它们为两个主要的arg1高亚(arg1highsubpopulations)定义了不同的标记物，而ly6c+细胞与arg1低亚组(arg1lowsubsets)高度相关。与该数据一致，pdpn、gpnmb和cx3cr1的qpcr分析检测到，与ly6c+相比，arg1和trem2转录物的表达水平更高(图2d-e)。[0277]为了进一步验证这些结果，本发明人分析了来自mca205小鼠肿瘤的cd45+cd11b+细胞，用相同的细胞表面标记物对其进行染，描绘了tme内不同的arg1+和arg1-肿瘤内髓样细胞。他们验证了pdpn高(pdpnhigh)和ly6c高(ly6chigh)亚组可以通过流式细胞仪可作为单独的体被清楚地检测到。此外，pdpn高髓样细胞与cx3cr1高(cx3cr1high)和gpnmb高(gpnmbhigh)标记物密切相关(图2f)。为了进一步设计分选策略，并表征arg1+和arg1-肿瘤内髓样细胞，使用cytof质谱-细胞仪来分析mca205的肿瘤内免疫细胞。由单细胞数据定义的大量蛋白质的umap分析，揭示了与facs分析中观察到的结果相似的结果(图2g)。cytof结果进一步证实了转录发现，定义了由pdpn和ly6c标记的两个不同的髓样细胞。与单细胞数据一致，pdpn细胞与cx3cr1、trem2、arg1和cd206(mrc1)的表达重叠(图2g和4f)。总之，arg1表达的ins-seq分析，定义了共享arg1和trem2受体表达的两个不同髓样细胞的分子特征：肿瘤相关巨噬细胞和调节性髓样细胞。[0278]trem2促进t细胞功能障碍和肿瘤免疫逃逸[0279]为了证实ins-seq肿瘤图谱，并获得肿瘤相关髓样细胞的更深入的分子特征，从mca205肿瘤中分选免疫细胞(cd45+)，用于mars-seq分析。元细胞算法(metacellalgorithm)用于从单细胞rna-seq数据中识别同质细胞，得到115个元细胞的图谱(图3a)。从骨髓图谱中去除淋巴细胞、粒细胞和dc，并对它们进行独立分析(图5a)。与ins-seq肿瘤图谱相似，arg1表达与trem2和pdpn表达高度相关，而ly6c、ccr2和plac8代表arg1-髓样细胞(图3b)。与该分析一致，arg1+trem2+细胞可以细分为两个不同的程序：tams，其特征为成熟的巨噬细胞标记物，例如cx3cr1、apoe和c1qa，以及mreg，它们是表达gpnmb、il7r和几种缺氧相关基因的单核细胞样细胞，例如hilpda、hmox1和vegfa(图3b-d)。发现多种tfs与骨髓抑制程序相关，包括已知的调节剂和以前与骨髓抑制性细胞无关的几种tfs(图3e)。本发明人训练了lasso-正则化交叉验证线性模型(lasso-regularizedcrossvalidatedlinearmodel，star方法)，仅基于tfs的表达式以高精度预测不同的程序(图3e和5b)。maf、cebpb、atf3和hif1a被识别为潜在mreg调节剂，spi1和hif1a被识别为tam的调节剂。富含i型干扰素信号传导(typeiinterferonsignaling)的单核细胞簇显示出stat1、irf9和irf7的tf富集。[0280]为了更好地理解arg1+细胞的调节机制，本发明人进一步分析了单细胞数据，寻可能干扰抑制性髓样细胞积累的潜在调节剂。其中，本发明人将trem2确定为有希望的靶标。trem2与arg1+髓样细胞密切相关，并且已经显示在各种病理中促进髓样细胞增殖、存活和免疫抑制(gervois和lambrichts，2019；zhong等人，2017)。trem2还被示出在人类肿瘤的髓样细胞中表达，其在小鼠肿瘤模型中的缺陷消除了肿瘤生长(tang等人，2019；zhang等人，2018)。trem2+/+(wt)和trem2-/-小鼠中的mca205肿瘤生长之间的比较显示，trem2-/-小鼠中的肿瘤体积显著减少(图3f和5c)。为了进一步研究trem2在肿瘤内免疫调节中的作用，本发明人对来自携带mca205的小鼠、来自trem2+/+和trem2-/-背景的免疫细胞进行了scrna-seq，捕获了总共15,808个qc阳性细胞。针对表达trem2的髓样细胞，本发明人发现与wt相比，trem2-/-小鼠中tme中的mreg体显著减少，同时tam体增加(图3g)。对wt和trem2-/-小鼠淋巴样区室的检查揭示了cd8+功能障碍t细胞(表达pd1和tim3)的显著降低，以及nk和细胞毒性t细胞的显著扩增(图3g)。为了评估不同肿瘤浸润性髓样细胞对活化t淋巴细胞增殖的功能影响，使用t细胞增殖测定。肿瘤浸润性髓样细胞(mreg、tams和ccr2+)被分离、facs分选，并与细胞增殖染料标记的脾分离的初始cd8t细胞(cd8tcells共培养，用α-cd3和α-cd28活化。尽管与肿瘤内ccr2+单核细胞共培养的cd8+t细胞示出完全增殖行为，而没有抑制的迹象，但我们观察到与cx3cr1+tam细胞共培养的活化的cd8+t细胞的增殖显著减少，并且当与gpnmb+mreg细胞共培养时，甚至出现更明显的抑制表型(图3h)。总之，结果表明，arg1+肿瘤浸润性髓样细胞包含两种分子不同的髓样细胞：tam和mreg。trem2敲除小鼠显示，虽然两个体都由trem2表达定义，但只有mreg体受trem2切除(ablation)的影响。重要的是，trem2缺乏(deficiency)导致mreg、功能障碍的cd8+t细胞和肿瘤生长的显著减少。[0281]尽管已经结合本发明的特定实施方式描述了本发明，但是显然，许多替换、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有这些替换、修改和变化。[0282]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用并入本文。此外，在本技术中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被解释为必要的限制。[0283]此外，本技术的任何优先权文件通过引用整体并入本文。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种降低髓样细胞免疫抑制活性的方法，所述方法包括使髓样细胞与有效量的试剂接触，所述试剂特异性降低表达髓样细胞触发受体2(trem2)和跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)两者的髓样细胞的量和/或活性，从而降低髓样细胞的所述免疫抑制活性。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接触在体内进行。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接触在体外进行。4.一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的试剂，所述试剂特异性下调表达髓样细胞触发受体2(trem2)和跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)两者的主体的髓样细胞的量和/或活性，从而所述癌症。5.一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括：(a)根据权利要求3所述的方法降低髓样细胞的所述免疫抑制活性，其中所述髓样细胞来自所述主体；随后(b)将所述髓样细胞移植至所述主体，从而所述癌症。6.一种在有需要的主体中癌症的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的：(i)第一试剂，所述第一试剂下调trem2的量和/或活性；和(ii)第二试剂，所述第二试剂特异性下调gpnmb的量和/或活性，从而所述癌症。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括双特异性抗体。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述双特异性抗体的第一靶标是trem2，所述双特异性抗体的第二靶标是gpnmb。9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一试剂和所述第二试剂是抑制性抗体。10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述双特异性抗体与细胞毒性剂结合。11.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述癌症是实体癌。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述实体癌选自由肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌组成的组。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述肺癌是非小细胞肺癌。14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述肺癌是小细胞肺癌。15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述肝癌是肝细胞癌。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，还包括向所述主体施用有效量的检查点抑制剂。17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，还包括向所述主体施用有效量的布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂选自由依鲁替尼、阿卡替尼和司培替尼组成的组。19.一种双特异性抗体，包括能够特异性结合trem2的第一抗原结合结构域和能够特异性结合gpnmb的第二抗原结合结构域。20.一种主体癌症的方法，包括：(a)分析所述主体样品中表达trem2和gpnmb两者的髓样细胞的存在；和(b)当所述髓样细胞的量高于预定量时，用有效量的靶向trem2和/或gpnmb的所述
试剂主体；或者当所述细胞的量低于预定量时，用有效量的化疗剂所述主体，所述化疗剂不同于靶向trem2和/或gpnmb的所述试剂。21.根据权利要求20所述的方法，其中，靶向trem2和/或gpnmb抗体的所述试剂是抗体。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述抗体与细胞毒性剂结合。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，所述癌症是实体癌。24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述实体癌选自由肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌组成的组。25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，还包括向所述主体施用有效量的检查点抑制剂。26.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，还包括向所述主体施用有效量的布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂选自依鲁替尼、阿卡替尼和司培替尼。

技术总结

公开了一种降低髓样细胞免疫抑制活性的方法。该方法包括使髓样细胞与有效量的试剂接触，所述试剂特异性降低同时表达髓样细胞触发受体2(Trem2)和跨膜糖蛋白NMB(Gpnmb)的髓样细胞的量和/或活性。该方法可用于癌症。还公开了抗体和双特异性抗体。公开了抗体和双特异性抗体。公开了抗体和双特异性抗体。

技术研发人员：

艾多

受保护的技术使用者：

耶达研究及发展有限公司

技术研发日：

2021.01.28

技术公布日：

2022/11/8