国际遗传学杂志2020年10月15日第43卷第5期Int J Genet Oct.15,2020,Vol.43,No.5•295•
的研究和应用现状
韩雪李婷范云帆顾伟付英梅
哈尔滨医科大学微生物学教研室150081
通信作者：付英梅，Email:fuyingmei@hrbmu.edu
【摘要】结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，感染人数众多。控制结核病的 关键在于早发现早，而目前的结核病诊断方法均不同程度地存在着灵敏度低、周期长等
问题，不能满足临床需求。通过测序发现血液中存在许多游离的小RNA，且血液比痰液等更
易获取和定量，所以以血液中游离小RNA为标志物的检测方法应运而生。目前已经有诸多
研究探索了人源的游离小RNA作为诊断结核病的外周血生物标志物的效能，并且也有少数
研究报道了人类外周血中存在的个别结核分枝杆菌的sRNA。
【关键词】循环游离RNA；小RNA；结核病
基金项目：国家科技重大专项(2017ZX10201301-003-005)
D0I:10.3760/cma.j231536-20200617-00046
Current status of research and application of free circulating small RNA in the diagnosis of tuber・
culosis
Han Xue,Li Ting,Fan Yunfan,Gu Wei,Fu Yingmei
Microbiology Department,Harbin Medical University,Harbin150081,China
Corresponding author:Fu Yingmei,Email•fuyingmei@hrbmu.edu
[Abstract]Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis,
which infects a large number of people.The key to controlling tuberculosis is early detection and early
treatment；however,the current tuberculosis diagnostic methods have the problems of low sensitivity and
long cycle,which does not meet the clinical needs.Through sequencing,it is found that there are many
free small RNA in blood.The blood is easier to obtain and quantify than sputum,so the detection method
based on free small RNA in blood arises at the historic moment.At present,many studies have explored
the efficacy of human free small RNA as a peripheral blood biomarker for the diagnosis of tuberculosis,
and a few studies have reported the presence of individual Mycobacterium tuberculosis sRNA in human
peripheral blood.
[Key words]Circulating free RNA；Small RNA；Tuberculosis
Fund program:Major National Science and Technology Project(2017ZX10201301-003-005)
DOI：10.3760/cma.j231536-20200617-00046
结核病(tuberculosis,TB)是一种可侵犯多种脏器的慢性传染病，因感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所引起，以肺部结核最为常见。2018年，全球结核发病率约130/100000，新增感染人数1000多万。全球死亡率约16/100000，估算死亡数约为124万。结核病自2007年以来一直位居单一传染性疾病死因之首。2018年中国结核病发病率约为
.296•国际遗传学杂志2020年10月15日第43卷第5期Int J Genet Oct.15,2020,Vol.43,No.5
61/100000，新发患者数约为86.6万。中国结核病死亡率为2.6/100000，死亡数为3.7万⑴。结核病诊断方法均不同程度地存在着灵敏度低、周期长等问题，不能满足临床需求，研究新的诊断方法具有重要意义。
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1细菌胞外游离RNA
1.1细菌胞外游离RNA产生途径和分类
细菌的胞外游离RNA—部分来源于细菌裂解产生，一部分通过细胞外囊泡将RNA分泌到胞外。细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径在40~1000nm，由微囊泡(microvesicles,MV)和外泌体(exosomes)组成。外泌体是磷脂双分子层包围的细胞外囊泡，直径为50-100nm⑵。革兰氏阴性细菌产生的细胞外囊泡来源于外膜，因此被称为外膜囊泡(outer-membrane vesicles,OMV)o 细菌胞外RNA包括编码RNA和非编码RNA。Valadi等⑶发现由肥大细胞衍生的细胞外囊泡中含有mRNA和miRNA，而在其他研究中检测到细胞外囊泡中还含有lncRNA、tRNA、rRNA、piRNA、YRNA、小核仁RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)和小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)等3。由免疫细胞释放的外泌体可以对miRNA进行选择性富集并将其传递到受体细胞中，预示着RNA进入细胞外囊泡是有选择性的⑹。
1.2细菌胞外游离RNA的作用
在生理和病理过程中起重要作用的细胞外囊泡广泛存在于人体中，可以在血液、尿液、唾液、乳汁等体液中被检测到，携带细胞来源的相关蛋白质、脂质、DNA和RNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移和免疫调节等，这是其可以作为疾病标志物的基础⑵o
细菌外膜囊泡介导的蛋白质向宿主细胞的传递是宿主与病原体交流的重要机制。有报道发现，细菌外
膜囊泡中存在sRNA，具有靶向宿主mRNA的功能，铜绿假单胞菌外膜囊泡中的一种高丰度RNA(small RNA,sRNA)可靶向LPS 诱导的MAPK通路，减弱人气道上皮细胞和小鼠肺组织的天然免疫反应〔7"
结核分枝杆菌的RNA也会进入宿主的细胞外囊泡中。通过结核分枝杆菌SecA2依赖的途径将结核分枝杆菌RNA传递到巨噬细胞来源的细胞外囊泡中，这些携MTB RNA的细胞外囊泡可以激活受体巨噬细胞中宿主的RIG-I/ MAVS/TBK1/IRF3RNA信号传感通路，导致受体细胞产生I型干扰素⑻。
2外周血循环游离RNA标志物
目前，已有多项研究探索了结核病的外周血游离小RNA标志物，包括miRNA⑼、长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)等。
2.1外周血循环游离miRNA作为结核病的生物标志物
Cui等问通过对患者、非患者和健康对照者，每组各64例的血浆miRNA 进行检测，发现miR-769-5p,miR-320a和miR-22-3p可以很好的区分结核患者和健康对照者，可将其作为诊断结核病的潜在血液生物标志物。Ndzi等2和Fu等g在活动性结核患者和健康对照者的血浆(AUC为0.814)和血清中(AUC为0.831)通过RT-qPCR检测，均发现miR-29a在区分活动性结核和健康对照者方面都表现岀了良好的诊断性能，可用作检测活动性感染的标志物。
2.2外周血循环游离IncRNA作为结核病的生物标志物
He等问利用IncRNA芯片扫描技术研究了结核患者、社区获得性肺炎和健康人血浆中IncRNA的差异表达，并用RT-qPCR验证了在微阵列中发现的2个差异表达的IncRNA (ENST00000354432和ENST00000427151)，发现这2种IncRNA在结核患者中的表达量均高于社区获得性肺炎和健康人(P<0.05)o Chen等Z在33例TB患者和11例健康对照者中使用微阵列研究了血浆中的IncRNA，发现NR_038221,NR_003142和ENST00000570366被上调，而ENST00000422183被下调。由4个IncRNA组成的诊断模型，AUC的值为0.845(灵敏度为79.2%，特异性为75%)o综上，提示血浆中IncRNAs可作为结核病快速诊断的潜在分
子生物学标志物。
2.3外周血循环游离circRNA作为结核病的生物标志物
circRNA是一类新型的内源性非编码RNA，通过缓冲其对mRNA靶标的抑制或螯合特定的miRNA，在基因表达的调节中起着至关重要的作用。与传统线性RNA相比，具有共价闭合连续环的circRNA可以抵抗RNAse消化，从而在外周血，间质液和唾液中存活，这使得它们可以在样品处理过程中选择性富集，使其比其他类型的RNA更适合用作分子诊断生物标志物的良好候选物问o Huang等通过RT-qPCR 法对120例TB患者和100例健康对照者血浆中circRNA进行检测,circRNA hsa_circ_0001953和hsa_circ
_0009024组合后的ROC曲线下面积为0.915，表明其可能代表用于活动性结核诊断的新型血浆生物标志物。Yi等g在32例活动性患者和29例健康对照者中用RT-qPCR方法用于检测血浆样品中circRNA的差异表达水平，发现hsa_circRNA_103571在活动性结核病患者中显著降低,ROC曲线分析显示AUC为0.838，表明hsa_circRNA_l03571可以将活动性结核病组与健康对照组分开，证明其对活动性结核病诊断具有重要价值。
但随着RNA深度测序技术的发展和应用不断发现，血液中的游离小RNA，除了这些人源的非编码小RNA夕卜，也有外来物种的小RNA，例如，细菌来源的小RNA[17]o有研究报道，结核患者外周血中能够检测到结核菌的sRNA，且检出率高于健康对照问。这些sRNA 不易在血液中被酶降解，外周血中细菌来源的RNA值得作为疾病的检测标志物加以研究。
导电布双面胶3结核分枝杆菌sRNA
细菌中既含有经典的mRNA、tRNA和rRNA 分子，也存在着大量长度在50-500nt的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)，即小RNA[闵。它们主要位于基因间区，也有的位于编码基因5PTR和3，UTR区域。研究表明，这类sRNA参与很多生物学过程，如细菌的转录调控、RNA加工与修饰、mRNA稳定、mRNA翻译、蛋白质降解、质粒复制和细菌感染等〔如。细菌内的sRNA可响应环境信号，受环境因素诱导而发生表达改变，继而通过对靶基因的调节，帮助细菌自身适应温度、离子浓度、pH、氧化应激或氧浓度、抗生素等环境因素的变化⑵初。
3-1结核分枝杆菌sRNA在感染中的作用细菌sRNA通过转录后调控基因表达，在控制细菌毒力、应激反应和生理代谢等方面发挥重要作用。感染时，进入宿主体内的细菌的sRNA可以感知外界的环境变化，通过调节应激刺激相关基因的表达来抵御宿主的防御系统。Salina等⑵)发现MTS1338直接参与了分枝杆菌和宿主免疫系统之间的相互作用。小鼠体内感染期间,IFN-7活化的巨噬细胞中MTS1338的表达量增加。体外实验表明，MTS1338的表达受转录调节剂D os R的控制，并在低氧和NO诱导下被激活〔如。MTS1338在分枝杆菌引发的疾病的发病机制中有重要的潜在作用。Gerrick 等冋通过对一种与铁相关的结核病分枝杆菌调节性sRNA MrsI进行研究，发现MrsI可以影响暴露于铁饥饿，氧化应激和膜应激条件下基因的表达，且对于分枝杆菌中的保铁反应至关重要。
3.2外周血结核分枝杆菌小RNA在诊断结核病中的研究现状
已有研究证明宿主基因编码的miRNAs在结核感染过程中可参与宿主与病原体的相互作用，可能在抑制细胞内病原体的免疫反应中起关键作用①如。在血清、唾液、尿液等多种体液中均可检测到差异表达的宿主miRNAs，表明其在结核感染中作为诊断标志物的潜力。而关于细胞内病原体编码的miRNAs的研究却很少，Chakrabarty等期对肺外结核患者的血清样本进行了小RNA测序，发现在结核分枝杆菌感染期间，患者血清中有20个循环miRNAs上调，5个循环miRNAs下调。其中有6个表达上调的miRNAs是由结核分枝杆菌基因组编码的。而后基于RT-qPCR分析显示，与15例健康对照相比，结核分枝杆菌基因组编码的MTB-miR5在15例和22例肺外结核患者血清样本中表达上调。
4小结
目前已经有诸多研究探索了人源的非编码RNA作为诊断结核病的血浆生物标志物的效能，并且也有少数研究报道了人类血浆中存在的个别结核分枝杆菌的sRNA。但结核分枝杆菌的sRNA在血浆中的含量如何，哪些sRNA适合作为诊断标志物，还不甚清晰。研究结核分枝杆菌的细胞外sRNA的表达情况及表达机制，探讨它们在诊断结核病中的作用具有很好的研究价值。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期:2020-06-17)
•读者•作者•编者•
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