胡莉蔓陈旭央阮旦青（乐清市人民医院儿科，温州325600）
中图分类号R392文献标志码A文章编号1000-484X（2022）01-0045-06
［摘要］目的：探讨紫草素对病毒感染的影响及其作用机制。方法：C57BL/6J小鼠用水疱性口炎病毒（VSV）感染后，不同浓度紫草素通过腹腔注射处理小鼠，观察小鼠的生存率以及肝、脾和肺组织中的VSV病毒滴度和VSV-G病毒基因的转录水平变化；H&E组化实验检测肺部组织的损伤和炎症细胞的浸润。RT-PCR检测小鼠肝脏、脾脏及肺中IFN-β和IL-6的mRNA 表达。在细胞实验中，用VSV病毒感染经不同浓度紫草素预处理的原代巨噬细胞，利用RT-PCR及ELISA实验方法检测IFN-α和IFN-β的mRNA水平及蛋白水平。Western blot检测p38、ERK、JNK、p65、TBK1、IRF3蛋白磷酸化水平。结果：紫草素处理能够显著提高VSV病毒感染小鼠的生存率；H&E组化实验结果表明，VSV病毒感染小鼠在紫草素处理后其肺组织结构的损伤和炎症细胞的浸润与对照组相比明显减少；VSV病毒感染小鼠在紫草素处理后其肝、脾和肺组织中的VSV滴度和VSV-G mRNA 与对照组相比明显降低，而IFN-β的mRNA水平显著升高；在细胞实验中，紫草素能够显著提高巨噬细胞抵抗病毒感染的能力，抑制病毒基因VSV-G mRNA的表达。紫草素能够促进病毒感染的巨噬细胞诱导IFN-α和IFN-β的产生，然而TNF-α没有明显差异。此外，利用Ⅰ型干扰素受体的阻断抗体（IFNAR1Ab）来阻断Ⅰ型干扰素的信号通 路，发现紫草素并不能抑制VSV病毒的扩增和复制。Western blot实验发现在病毒感染过程中，紫草素能够显著促进巨噬细胞IRF3的磷酸化。结论：紫草素通过促进IRF3激活来上调Ⅰ型干扰素的产生从而抑制病毒感染。
［关键词］紫草素；病毒感染；Ⅰ型干扰素；巨噬细胞
Shikonin inhibits virus infection by promoting production of typeⅠinterferon in macrophages
HU Liman，CHEN Xuyang，RUAN Danqing.Department of Pediatrics，People's Hospital of Yueqing，Wenzhou 325600，China
［Abstract］Objective：To investigate the effect of shikonin on virus infection and its mechanism.Methods：C57BL/6J mice were infected with VSV（vesicular stomatitis virus），and then treated with different concentrations of shikonin through intraperitoneal injection.The survival rate of the mice and the VSV titer in the liver，spleen and lung were detected.H&E histochemical analysis was used to detect the damage of mouse lung tissue and the infiltration of inflammatory cells.RT-PCR was used to detect the mouse IFN-βand IL-6mRNA expression in the liver，spleen and lung.In vitro experiments，VSV was used to infect bone marrow derived macro‐phages pretreated with different concentrations of shikonin，and then RT-PCR and ELISA were used to dete
ct IFN-α（interferon-α）and IFN-βmRNA and protein levels.p38，ERK，JNK，p65，TBK1，IRF3protein phosphorylation levels was detected by Western blot. Results：Shikonin could significantly increase the survival rate of mice infected with VSV；H&E histochemistry showed that the damage of lung tissue structure and the infiltration of inflammatory cells were significantly reduced in shikonin treated mice after VSV infection. VSV titers and VSV-G mRNA were decreased in the liver，spleen and lung of mice after treatment with shikonin.Furthermore，the level of IFN-βwas significantly increased.In addition，shikonin could significantly improve the ability of macrophages to resist viral infection and inhibit the expression of VSV-G mRNA.Shikonin could promote the production of IFN-αand IFN-βinduced by viral infection，but there was no significant difference in TNF-α.Furthermore，the typeⅠinterferon receptor blocking antibody（IFNAR1Ab）was used to block the typeⅠinterferon signal pathway，and found that shikonin could not inhibit the replication of the VSV virus.Shikonin could significantly promote the phosphorylation of IRF3in macrophages after viral infection.Conclusion：Shikonin can promote the production of typeⅠinterferon and inhibit virus infection by up-regulating the activation of IRF3.
［Key words］Shikonin；Virus infection；TypeⅠinterferon；Macrophage
2019年12月发现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是一种新型单链RNA（ssRNA）病毒，它能引起严
重的呼吸系统疾病（COVID-19），且导致了全球大流行，对全人类的健康构成了严重威胁［1］。在病毒感染发生时，天然免疫是抵抗病毒感染的第一道防线。天然免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2022.01.008
作者简介：胡莉蔓，女，主治医师，主要从事天然免疫研究，E-mail：blue_moon3974@163。
通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体相关的分子模式（pathogen associ‐ated molecular patterns，PAMPs），如病毒核酸RNA和DNA，来响应病毒感染，快速启动免疫应答反应［2］。病毒RNA主要由TLRs成员（TLR3、7、8）和RLRs成员（RIG-1、MDA5）等受体识别［3］；病毒DNA主要由STING等受体识别。病毒核酸成分被模式识别受体识别后，募集下游接头蛋白包括TRIF、MAVS和STING，随后激活下游激酶TBK1，从而激活NF-κB 和转录因子IRF-3/7并诱导Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的产生。Ⅰ型干扰素能够诱导大量干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表达。干扰素诱导基因不仅可以抑制病毒从入侵到释放的多个阶段，还可以反馈调节干扰素的表达，从而最终控制病毒感染［4-5］。但是，诸如H1N1、HSV等病毒同样可以通过抑制Ⅰ型干扰素的产生来逃脱宿主的杀伤［6］。因此，促进天然免疫应答是抵抗包括冠状病毒SARS-CoV-2在内的病毒感染的有效策略。
紫草素是从传统中药紫草中提取的萘醌类化合物［7］。研究发现紫草素能够抑制炎症反应、抗细胞凋亡、抗氧化和促进血管生成，从而能够改善糖尿病患者早期视网膜病变等症状［8-9］。此外，紫草素在肿瘤的发生发展中具有重要作用，通过阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭、诱导自噬和坏死等方式，紫草素可以有效抑制乳腺癌、宫颈癌等肿瘤的发生发展［10-14］。但是，紫草素在病毒感染中的作用尚不清楚。本课题以小鼠和巨噬细胞为研究对象，旨在探讨紫草素对小鼠和巨噬细胞抵抗水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的影响及其机制，并为抵抗SARS-CoV-2提供有效策略。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1小鼠C57BL/6J小鼠（6~8周龄）购自SIPPR-BK实验动物有限公司。将所有小鼠饲养在浙江大学实验室动物中心（没有特定病原体的环境），所有动物实验均按照动物伦理委员会批准的规程进行（批号：ZJU-BEFS-2019015），并符合机构指导原则。
1.1.2原代巨噬细胞骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages，BMDM）由小鼠骨髓诱导产生。从小鼠的股骨和胫骨收集骨髓细胞，将20ng/ml重组小鼠M-CSF（R&D公司，416-ML）
添加到含有10％FCS的RPMI1640培养基中，诱导BMDM。
1.1.3试剂紫草素（MCE公司，HY-N0822）；IFN-βELISA试剂盒（Invivogen公司，luex-mifnbv2）；IL-6 ELISA试剂盒（Invitrogen公司，88-7064-88）；RNAiso plus（TaKaRa公司，9109）；逆转录试剂盒（Toyobo公司，FSQ-201）；SYBR Green master Rox（Roche公司，***********）；细胞裂解缓冲液（Cell Signling Tech‐nology公司，9803）和蛋白酶抑制剂（Sigma公司，P8340）；BCA试剂盒（Pierce公司，23235）；Pierce化学发光ECL试剂盒（Thermo公司，32209）；RNAiso plus试剂（TaKaRa公司）；逆转录酶（Toyobo公司）；SYBR Green master Rox（Roche公司）；聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad公司）；TBK1抗体（3504）、p-TBK1抗体（5483）、IRF3抗体（4962）、p-IRF3抗体（4947）、p-JNK 抗体（9251）、JNK抗体（9252）、p-p65抗体（3033）、p65抗体（8242）、p-p38抗体（9215）和p38抗体（9212）均购自CST公司。
1.2方法
1.2.1病毒感染用VSV（MOI=0.1或1）或者VSV-GFP（MOI=1）感染骨髓来源的巨噬细胞进行细胞实验。通过腹腔内注射VSV（剂量1×108PFU/g）感染小鼠进行体内研究。
1.2.2VSV TCID50测定分别获取感染VSV小鼠的脾脏、肝脏和肺脏组织上清以及感染VSV的巨噬细胞上清液，利用倍比稀释方法稀释上清液，加入到Vero细胞上进行感染。然后用含有0.6％低熔点琼脂糖的生长培养基覆盖细胞。16h后，利用
0.5％结晶紫进行染，并计数形成的噬菌斑。
1.2.3细胞分析原代巨噬细胞在GFP-VSV感染16h后，用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤。重悬于100µl PBS中，通过流式细胞仪（FACS）分析细胞。
1.2.4ELISA收集细胞上清液或外周血，使用ELISA试剂盒检测IFN-β或IL-6细胞因子的浓度。
1.2.5荧光定量PCR根据试剂说明，使用RNAiso plus试剂从细胞中提取总RNA。用逆转录酶逆转录形成单链cDNA。SYBR Green master Rox用于定量实时逆转录酶-PCR分析。qPCR引物如下：VSV-G mRNA：正向5′-ACGGCGTACTTCCAGATGG-3′，反向5′-CTCGGTTCAAGATCCAGGT-3′；TNF-αmRNA：正向5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，反向5´-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3´；IFN-βmRNA：正向5´-GGGAGAACTGAAAGTGGGAAA-3´，反向
5´-ACCTGCAAGATGTGGCAAAG-3´；β-actin mRNA：正向5´-GATGACGATATCGCTGCGCTG-3´，反向5´-GTACGACCAGAGGCATACAGG-3´。
1.2.6Western blot细胞用裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂处理后，离心并收取裂解上清，用BCA试剂盒测定上清中蛋白浓度。蛋白质在变性处理后，将其等质量的加入到十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行凝胶电泳和转膜将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封闭液处理后，分别用以下的抗体
和相应的二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜上蛋白通过Pierce化学发光ECL试剂处理后，通过BIO-RAD Gel Doc XR凝胶成像仪拍照获取蛋白条带。抗体的稀释比例如下：TBK1（D1B4；3504，1∶1000）、IRF3（4962，1∶1000）、p-IRF3（4D4G；4947，1∶5000）、p-JNK（9251，1∶3000）、JNK（9252，1∶1000）、p-p65（3033，1∶3000）、p65（8242，1∶1000）、p-p38（9215，1∶3000）和p38（9212，1∶1000）。
1.3统计学分析本研究中的实验至少独立重复3次。数据用xˉ±s表示，实验各组数据之间的统计学比较采用Student´s t-test，小鼠存活期实验采用Kaplan-Meier统计学方法进行统计分析，P<0.05时认为差异有统计学意义。
2结果
2.1紫草素在小鼠体内抑制VSV病毒感染为了探索紫草素对小鼠病毒感染的影响，记录了VSV病毒感染后96h小鼠的生存率。在感染VSV病毒后，对照组小鼠在12h开始死亡。相比之下，通过腹腔注射紫草素可以延长小鼠的存活时间并提高其生存率（20mg/kg时为40%，40mg/kg时为70%）（图1A）。随后，发现接受紫草素处理的小鼠肝、脾和肺组织中的VSV滴度和VSV-G mRNA水平明显降低（图1B、C）。H&E组化实验结果表明，VSV病毒感染小鼠在紫草素处理后其肺组织结构的损伤和炎症细胞的浸润与对照组相比明显减少（图1D）。
2.2紫草素在小鼠体内促进Ⅰ型干扰素的产生Ⅰ型干扰素在抗病毒天然免疫反应中发挥着关键作用，因此本研究探讨紫草素是否会影响Ⅰ型干扰素的产生。VSV感染的小鼠，经紫草素处理后小鼠外周血中IFN-β浓度与对照组相比显著升高（图2A），而IL-6的浓度没有明显差异。评估小鼠肝、脾和肺组织中IFN-β的表达，发现20mg/kg和40mg/kg的紫草素均能够增加肝、脾和肺组织中IFN-β的表达（图2B）。以上结果表明紫草素特异性增强小鼠RNA病毒感染中IFN-β
的产生。
Note：A.ELISA analysis of IFN-βand IL-6in peripheral blood of mice treated with DMSO，20mg/kg or40mg/kg shikonin after intraperi‐toneal injection with VSV for24h；B.RT-PCR analysis of IFN-βmRNA in the liver，spleen and lung of mice treated with DMSO，20mg/kg or40mg/kg shikonin after intraperitoneal injection with VSV for24h.Data are xˉ±s and representative of three indepen‐dent experiments.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.
图2紫草素在小鼠体内促进Ⅰ型干扰素的产生
Fig.2Shikonin enhances production of typeⅠinterferon in
mice
Note：A.The survival curve of8-week-old mice treated with DMSO，20mg/kg or40mg/kg shikonin after intraperitoneal injection with VSV；B.Determination of VSV loads in lung，spleen and liver of mice after infection with VSV for24h；C.RT-PCR analysis of VSV transcripts in lung，spleen and liver of mice in B；D.
Hematoxylin and eosin staining of lung sections from mice in B.
Scale bars，100µm.Data are xˉ±s and representative of three in‐dependent experiments.***.P<0.001.
图1紫草素在小鼠体内抑制VSV病毒感染
Fig.1Shikonin inhibits VSV infection in mice
2.3
紫草素抑制巨噬细胞中VSV 病毒的感染
IFN -β主要由巨噬细胞产生，为了进一步明确紫草素在病毒感染中的作用，用不同浓度的紫草素预处
理巨噬细胞后并用VSV 病毒感染，发现低剂量（0.5µmol/L ）和高剂量（1µmol/L ）的紫草素均能降
砂浆回收
低VSV 病毒滴度（图3A 、B ）。使用不同浓度的VSV （MOI=0.1和1）感染巨噬细胞，结果显示紫草素均能显著抑制VSV -G mRNA 表达（图3A 、B ）。随后，用带绿荧光的GFP -VSV 感染细胞，通过流式检测发现紫草素处理能够显著降低细胞GFP -VSV 的感染（图3C ）。这些数据表明紫草素能够抑制巨噬细胞中VSV 病毒的感染。2.4
紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制
VSV 病毒的感染
为了进一步验证紫草素对病毒
的抑制作用是否由Ⅰ型干扰素介导，在体外检测Ⅰ型干扰素和炎症因子的产生。在VSV 感染不同时间点，观察到紫草素处理后能够显著促进IFN -α
和IFN -βmRNA 的表达，而TNF -αmRNA 没有明显差异（图4A ）。用不同浓度的病毒感染后，在紫草素作用下，均能增强IFN -α和IFN -βmRNA 的表达（图4B ）。ELISA 结果表明VSV 病毒感染后，IFN -β蛋白水平在紫草素处理后能够显著增加，然而TNF -α表达却没有明显变化（图4C ）。利用Ⅰ型干扰素受体的阻断抗体（IFNAR1Ab ）来阻断Ⅰ型干扰素的信号通路，发现紫草素并不能抑制VSV 病毒的扩增和复
电工工具包
制（图4D 、E ）。上述结果表明，紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制VSV 病毒的感染。2.5紫草素促进VSV 病毒诱导转录因子IRF3的活化
Western blot 结果表明，紫草素处理不会显著调
控p38、ERK 、JNK 、p65和TBK1的磷酸化，但可以显著促进IRF3的磷酸化（图5）。上述数据表明紫草素通过上调IRF3活化来促进IFN -β
产生。
Note ：A.IFN -β，IFN -αand TNF -αmRNAs were detected by RT -PCR
in macrophages ，which pretreated with DMSO ，0.5µmol/L or
1µmol/L shikonin ，infected with VSV for indicated time ；B.IFN -β，IFN -αand TNF -αmRNAs were detected by RT -PCR in macro‐phages ，which pretreated with DMSO ，0.5µmol/L or 1µmol/L shikonin ，infected with VSV for 12hours at different multiplicity
of infection ；C.IFN -βand IFN -αwere detected by ELISA in macro‐phages ，which pretreated with DMSO ，0.5µmol/L or 1µmol/L shikonin ，infected with VSV for 24hours ；D.VSV loads analysis
of macrophages pretreated with shikonin or mIFNAR1Ab followed by infection with VSV for 6hours ；E.RT -PCR analysis of VSV transcripts in macrophages pretreated with shikonin or mIFNAR1Ab followed by infection with VSV for 6hours.Data are x
ˉ±s and representative of three independent experiments.*.P <0.05；**.P <0.01；***.P <0.001.
图4紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制VSV 病毒的感染
Fig.4
Shikonin inhibits VSV infection by promoting pro⁃duction of type Ⅰ
interferon
Note ：A ，B.VSV titer （A ）and VSV -G mRNA （B ）was detected in mac‐
rophages pretreated with DMSO ，0.5µmol/L or 1µmol/L shiko‐nin ，and infected with VSV at different multiplicity of infection
and times ；C.Flow cytometry analysis GFP positive macrophages after infection with GFP -VSV.Data are x
ˉ±s and representative of three independent experiments.*.P <0.05；**.P <0.01；***.P <0.001.
图3紫草素抑制巨噬细胞中VSV 病毒的感染
Fig.3
Shikonin inhibits VSV infection in macrophages
3讨论
近期临床研究显示，中药在新型冠状病毒
SARS -CoV -2感染引起COVID -19的中发挥着重要作用
［15-16］
。莲花清瘟已被国家卫生健康委批准用
于COVID -19的［17］。本研究也证明了中草药紫草素在小鼠体内和体外均能抑制VSV 病毒感染。因此，推测紫草素也可能抑制SARS -CoV -2的感染。
以往研究发现，紫草素具有抑制炎症、抗氧化以及抑制凋亡的作用［18-19］。在一些与炎症和肿瘤相关的疾病中，紫草素可以通过抑制炎症因子的释放和氧化应激来减轻疾病的严重程度，如糖尿病视网膜病变以及乳腺癌、宫颈癌等［9，12-13］。本研究使用VSV 病毒来探究紫草素在宿主抗病毒中的作用，结果表明，紫草素可以在体内和体外保护宿主，抑制RNA 病毒感染，并且证明紫草素是通过上调巨噬细
胞IFN -β来抑制病毒入侵。
以往研究发现紫草素能够通过多种机制发挥其作用。如紫草素能够抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡
［20］
。紫草素能够上调P38、ERK 和JNK 磷酸化，
从而促进凋亡相关蛋白PARP 和Caspase -3的表达，促进肿瘤细胞凋亡［21］。此外，紫草素也能够诱导ROS 聚集，促进肿瘤细胞凋亡［22-23］。紫草素还能通过抑制TLR4的表达抑制NF -κB 的信号通路，抑制
炎症因子的产生［24］。有文献报道紫草素通过活化PI3K/AKT 信号通路缓解心肌缺血/再灌注损伤中的心肌细胞损伤［25-26］。本研究发现紫草素在病毒感染
巨噬细胞后，能够显著上调转录因子IRF3的磷酸化水平，而没有显著改变NF -κB 信号通路的活化。IRF3是Ⅰ型干扰素的关键转录因子。因此，紫草素是通过促进IRF3的活化，促进Ⅰ型干扰素的表达和抗病毒作用。尚需进一步研究紫草素对其他类型细胞的影响，包括除巨噬细胞外的其他天然免疫细胞、适应性免疫细胞、组织结构细胞等。
综上所述，本研究结果显示紫草素可以通过增强IRF3活化，促进Ⅰ型干扰素的表达，来抵抗VSV 病毒感染。结果表明紫草素是一种优秀的、潜在的抗病毒候选药物。
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36955.
Note ：A.Immnuoblot analysis RIG signaling pathway phosphorylation
（-p ）or total protein in macrophages pretreated with DMSO or shi‐konin ，and infected with VSV for indicated hours ；B.Gayscale values of immunoblot analysis of phosphorylated （-p ）or total pro‐teins in lysates of macrophages treated as in figure 5A.Data are presented as the x阀门手轮
ˉ±s and are representative of three independent experiments.***.P <0.001.
图5
紫草素促进VSV 病毒诱导转录因子IRF3的活化Fig.5
Shikonin promotes activation of IRF3induced by VSV infection
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