DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路
在我们对DNA免疫刺激效应理解上的下一步飞跃始于意识到当被直接导入细胞质时非病原菌来源的DNA也是有免疫刺激性的。在我们实验室的调查中揭示dsDNA，当用胞质转染法转染时是一个IFN-Ⅰ和趋化因子基因如Cxd10,Cd5和Cd2潜在的诱导物在小鼠和人的树突细胞以及间质细胞。关于免疫原性的条件在添加的CpGDNA和转染的dsDNA之间是不同的。如果不考虑这些序列，胞质dsDNA仍然是有刺激性的并且可以诱导IFN-Ⅰ即使当它是甲基化的。这不只限于病原来源的DNA，因为当转染时那些缺乏CpG岛的小牛胸腺和人造DNA和E.coli以及HSV-1有相同的刺激性。此外，之前被证明由于缺乏TLR9表达而对CpG无反应的小鼠胚胎成纤维细胞当用DNA转染时表现出IFN-Ⅰ的诱导效应。这种dsDNA的IFN-Ⅰ刺激效应依赖于它的长度。长的dsDNA诱导更强的IFN-Ⅰ反应。只有dsDNA是有刺激性的；ssDNA如互补DNA(cDNA)被发现是免疫惰性的。这种刺激效应也只限于B型（B-DNA）的dsDNA而非Z型(Z-DNA)构象。B-DNA是一种dsDNA结构普遍出现的低能状态采用右手螺旋构象。相反，Z-DNA采用高能的左手螺旋结构在生理状态下出现较少。人造由AT重复聚（dA–dT）.聚（dT–dA）(聚（dA.dT）将来)dsDNA倾向于采用B型构象并且当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时可以诱导潜在的IFN-Ⅰ反应。另一方面，由GC重复组成的人造dsDNA，聚（dG-dC）聚（dC-dG） 聚（dG-dC）将来），采用Z型构象，当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时没有刺激性。这些DNA的第二结构仍然是完整的即使和基于脂质体的转染试剂混合时。
我们也通过研究在那时已知的其他的核酸感受器和信号分子是否参与B-DNA诱导IFN-Ⅰ的反应来探究机制。在胞质内感受dsRNA的TLR通路和RIG-Ⅰ通路没有参与，基于在缺乏MyD88/TRIF和RIG-Ⅰ的小鼠胚胎成纤维细胞上的试验研究。尽管胞浆DNA诱导IFN-Ⅰ反应不依赖于RIG-Ⅰ信号，我们表明在HEK293细胞中IPS-1对产生IFNβ的最优反应是必需的。这些数据在出版那时是令人不解的，但是现在我们知道RNA酶Ⅲ可以从局部镀锡poly(dA:dT)到刺激RIG-Ⅰ充当RNA中介。这个通路存在于人的细胞中，但在小鼠的细胞中是多余的（在之后的章节中讨论）。随后，我们把我们的注意力转向TBK1，之前发现对于在感染期间通过病毒的dsRNA诱导IFN-Ⅰ是必需的。TBK1是非经典的IκB激酶和IKKα以及IKKβ相关，是NF-κB活化的调节者。它在NF-κB活动和IFN-Ⅰ反应中起中介作用由TLR依赖和非依赖途径触发。TBK1也已证明对于当用CpGDNA刺激时类胞浆树突状细胞产生IFN-α是非必需的。和那个观察形成对比，我们表明IFNβ和其他的由B-DNA转染诱导的趋化因子反应在TBK1-/- 小鼠胚胎成纤维细胞是完全没有的。TBK1对于IRF3的二聚化是必须的，由B-DNA所诱导，但B-DNA诱导NF-κB激活是多余的。因此TBK1-IRF3信号轴对于由胞浆B-DNA刺激诱导IFN-Ⅰ
是至关重要的。
B-DNA的刺激效应也被发现是功能性的通过执行基因系列WT,TBK1-/-,IKKi-/-和TBK1-/-IKKi-/-基因双敲除小鼠胚胎成纤维细胞，由聚（dA:dT）所刺激。结果表明大多数的上调基因是干扰素诱导基因也是抗病毒相关基因如MX1和QASL2。因为这个原因，当用dsDNA预培养时，WT MEFs,而非TBK1-/- MEFs，能更好地免受水疱口炎病毒的威胁。除了越来越多的抗病毒反应外，TBK1依赖的通过DNA诱导IFN-Ⅰ的反应也被发现对DNA疫苗的功效至关重要。缺乏TBK1的小鼠不能诱导抗原特异性的CD4和CD8T细胞以及产生IFNγ脾细胞的增加频率，当用流行性感冒病毒DNA免疫时。
和我们的研究相似，Stetson et al.表明非微生物来源的dsDNA如果转入胞浆可以有刺激效应且由胞浆dsDNA引起的免疫激活特点不同于CpGDNA。作者们始于通过证明直接转入单核细胞增多性李斯特氏菌，嗜肺军团菌以及凋亡的哺乳动物细胞的DNA到巨噬细胞的胞液可以诱导潜在的IFNβ以及IL-6反应。这个反应不依赖于MyD88,TRIF和RIP2，因此不涉及TLR以及NOD1/2信号。通过进一步研究这个新的感受DNA的信号途径，他们合成了一个没有CpG岛的45bp的寡核苷酸并把它命名为干扰素刺激DNA（ISD）。ISD在细胞中不能
诱导任何细胞因子激活当被转染入免疫和非免疫细胞系。不同于CpG对浆细胞样树突状细胞的严格刺激，ISD能诱导所有细胞类型包括浆细胞样树突状细胞，常规树突状细胞，巨噬细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的IFN-Ⅰ。ISD产生IFNβ不依赖于TLR和NOD1/2或DNA修复机制的成员包括DNA-PK(Ku70)，ATM和ATR激酶，和PI-3K。更重要的是，他们表明ISD持续诱导稳健的IFNβ和IL-6,尽管用氯奎巨噬细胞，这已知抑制CpG DNA激活TLR9所需的酸化作用。因此提供了除TLR9外检测DNA的可选途径。
鉴定内源DNA感受器
当TLR9非依赖途径被发现以后，DNA诱导炎症的TBK1-IRF3依赖通路，有一系列的报导鉴定识别dsDNA的胞内受体的文章发表。现在已知细胞检测DNA导致炎症反应不是存在于TLR9和病原来源DNA中CpG岛之间的直接对话。随着dsDNA能够诱导TLR9非依赖性的IFN-Ⅰ反应，大量的非细胞膜联系的胞内dsDNA检测器被鉴定。除了AIM2和Ku70以外，诱导的炎性反应共同鉴定的DNA感受器迄今为止是通过TBK1-IRF3信号轴诱导IFN-Ⅰ。通过KU70诱导IFN-Ⅲ产生，然而AIM2炎性体激活导致IL-1β和IL-18的产生。我们将会重点用早期做出这个发现的文章分别描述鉴定的胞内DNA感受器。
Z-DNA结合蛋白-1（ZBP-1）
ZBP-1，也被认为是DNA依赖的干扰素调节因子（DAI）和DLM-1的激活物，是继TLR9之后最早被发现的胞浆DNA感受器。在被发现是胞浆DNA感受器之前，羽绒睡袋ZBP-1被认为在调节mRNA代谢中起作用并且作为肿瘤相关的蛋白参与主体对抗细胞压力反应。这是一个IFN-可诱导的基因产物最初被报道通过两个结合域结合Z-DNA。没有其他的研究去研究它和其他形式的DNA的相互作用。在2006年，Takaoka和同事观测到ZBP-1的表达在L929细胞（小鼠成纤维细胞系）中显著上调，当被转染人造B-DNA时。他们表明当用B-DNA和其他来源的DNA包括细菌，小牛胸腺以及人造Z-DNA刺激时ZBP-1参与IFN-Ⅰ反应的诱导，通过指出在ZBP-1表达的L929细胞中IFN-Ⅰ产量上调。敲除ZBP-1的细胞当用dsDNA刺激时不能诱导IFN-Ⅰ分泌。ZBP-1对检测DNA是特异性的并且不参与RNA诱导的IFN-Ⅰ反应。由于通过检测DNA在诱导IFN-Ⅰ所起的作用，ZBP-1被发现参与DNA介导的抗病毒反应。提前用胞浆dsDNA刺激的ZBP-1缺陷的L929细胞被发现和WT细胞相比对脑心肌炎病毒感染抵抗力弱。此外，IFNβ的表达被表明在感染了单纯疱疹病毒-1（HSV-1）而非鸡新城疫病毒（NDV）的ZBP-1缺陷细胞中下调，这两种病毒分别是DNA和RNA病毒。和这个观察平行，ZBP-1缺陷的L929细胞和WTL929杨梅采摘机细胞相比产生高的HSV-1病毒滴定度，然而WT和ZB
P-1-/-L929细胞对于NDV病毒的滴定度仍然相同。接下来，为了证明ZBP-1是DNA的受体，使用荧光共振能量转移（FRET）分析和免疫共沉淀分析表明它和B-DNA直接相互作用。显微镜检查试验表明ZBP-1主要位于细胞质内。
至于导致IFN-Ⅰ应答的信号通路，ZBP-1是利用TBK1-IRF3信号通路。它被表明在B-DNA刺激后诱导IRF3的二聚化。此外，TBK1和IRF3被证明和ZBP-1有生理上的联系，当用B-DNA刺激并用免疫共沉淀分析后。当ZBP-1,IRF3和TBK1之间的这种联系发生时，ZBP-1需要在丝氨酸352和353位置磷酸化。ZBP-1也可以通过B-DNA诱导介导NF-κB激活。详细的试验揭示ZBP-1包含两个受体相互作用蛋白（RIP）同型结构域（RHIMs）这可以募集含RHIM激酶受体蛋白激酶1和3（RIP1和RIP3）激活NF-ΚB。RIP3和RIP1是两个蛋白，之前被鉴定对通过TLR3信号调节NF-ΚB至关重要。
ZBP-1死亡或难以死亡
ZBP-1在检测和诱发DNA刺激的炎性反应和对抗病原的免疫在这个发现在之后的报道中受到了质疑。早期设计的研究ZBP-1和通过DNA诱导IFN-Ⅰ的实验都是在ZBP-1沉默的L929细胞上操作的。然而当用MEF细胞替代时从这些实验获得的数据不能再现。此外，有其他的
报导证明当用dsDNA转染或者用嗜肺军团菌感染人类细胞系HEK293和A549诱导IFN-Ⅰ和隔音房制作IL-8时ZBP-1是不需要的。也有报导证明它不参与肺炎双球菌和单纯疱疹病毒1美白美容液感染诱导IFN-Ⅰ。在我们的实验室，我们制造了ZBP-1-/-老鼠并研究它在dsDNA和DNA疫苗对固有和适应性免疫的影响中所起的作用。我们表明MEFs,GM-CSF和FLT-3配体培养的产生自ZBP-/-老鼠的树突状细胞当用dsDNA刺激时和WT细胞一样对普通水平死亡IL-6好，IFNβ和其他IFN-可诱导基因产生应答。我们也表明ZBP1小鼠和WT小鼠有着相同水平的抗体和T细胞应答-/-当用DNA疫苗免疫时，不像TBK1缺陷型小鼠对DNA预防接种无反应。除了这些观察结果，在一个独立的报导中说ZBP-1可以被用作接种疫苗的佐剂。用ZBP-1表达的质粒电击转化导入小鼠可以增加IFN-Ⅰ以及其他细胞因子和共刺激分子的表达量促进疫苗反应。与此同时，联合免疫OVA和ZBP-1表达质粒促进抗OVA的免疫反应产生。它也可以产生肿瘤防护性反应当用表达肿瘤相关的抗原生存素质粒联合免疫时。因此，到目前为止还不清楚ZBP-1是否在DNA检测上扮演了一个重要角。
TBK1和IKKε
TBK1和IKKε激酶的激活触发了一连串的信号通过转录因子包括IRF的成员及标准的NF-κB
家族的磷酸化。最近的发现表明TBK1和IKKε在细胞中RAS诱导的转化中起作用。TBK1由RalB-Sec5效应物复合物募集和激活，这对RAS起中介作用的转化是必需的。TBK1对于抑制细胞凋亡是必需的在应答RAS激活时，可能通过参与v-akt小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物（AKT）存活途径。相似的，IKKε也被鉴定为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路的效应器，和MAP激酶-ERK激酶（MEK）合作去促进转化。通过siRNA抑制增值，黏附和一些肿瘤细胞系侵袭可以损害IKKε表达。在前列腺癌疾病模型中，观察到IKKε表达水平和恶性肿瘤存在相关。
А αγε
干扰素基因刺激器（STING）依赖的胞浆DNA感受器和IFN-Ⅰ在细菌感染期间的反应
长久以来人们就知道向细胞内运送哺乳动物或细菌的dsDNA触发独立宿主的TLR9的促炎反应，并且微生物和宿主的DNA输送到胞液中刺激IFN-Ⅰ。此外，用细菌侵染在宿主细胞的胞液中复制诱导IFN-Ⅰ的产生。接下来的研究表明细菌表达分泌系统可以将微生物分子注入宿主细胞，或表达压片毒素它可以在吞菌作用后破坏噬菌体溶酶体膜也可以刺激IFN-Ⅰ反应。IFNα/β对胞浆DNA果蔬纤维代餐粉刺激或是细菌感染的应答诱导了一个相似的基因表达模式，并且同
时依赖于TBK1激酶和转录因子IRF3，但不依赖TLRs。这些结果和其他的一些证据导出了这样一个个结论：通过胞内PRRs感知细菌DNA是在各种病菌感染期间激活IFN-Ⅰ反应的原因。然而，某些细菌似乎在一些细胞系通过不同的激活机制去刺激IFN-Ⅰ产生，例如，细菌第二信使c-di-GMP和c-di-AMP或通过细菌的RNA。
重要地是，由胞内微生物DNA诱导的IFN-Ⅰ反应，c-di-GMP和c-di-AMP需要分子STING（也被称作MPYS和MITA）。STING似乎也是一个衔接分子，可以从大多数胞内DNA感受器转运信号到TBK1和IRF3，是c-di-GMP和c-di-AMP的直接感受器（或共感受器）。STING是一个跨膜蛋白是内质网的组分。在细胞内DNA存在的情况下，STING迅速地从内质网区通过高尔基体定位于细胞核周围一个独特的核内体，并且激活转录因子IRF3/7以及NF-κB刺激IFN-Ⅰ产生。此外，STING也表明其激活STAT6依赖的趋化因子产生且诱导选择性自噬（如下）。
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