视黄酸诱导基因-Ⅰ在家禽天然免疫应答中作用的研究进展 李雪峰;任梦婷;许丽文;王芳芳
【摘 要】家禽的天然免疫应答在抵抗病毒感染的过程中起着关键性作用,视黄酸诱导基因-Ⅰ (retinoic acid indueible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)作为细胞质内一类识别病毒双链RNA的模式识别受体,与天然免疫应答密切相关.它可通过RNA配体结合病原相关分子模式监测细胞质中的病毒RNA,此过程激活了RIG-Ⅰ及下游线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS),最终导致干扰素调节因子(IRF3/7)和核因子κB(NF-κcB)活化,诱导产生Ⅰ型干扰素等免疫细胞因子,进而使细胞做出相应的抗病毒天然免疫反应.但由于鸡体内缺乏RIG-Ⅰ基因,目前大多将鸭源或鹅源RIG-Ⅰ基因转染鸡成纤维母细胞(DF-1)研究RIG-Ⅰ基因在鸡感染禽类病毒时是否具有免疫功能.文章介绍了RIG-Ⅰ在家禽体内的表达及其介导的抗病毒天然免疫信号通路,并简述了RIG-Ⅰ在家禽体内抗病毒作用的研究概况,为抑制家禽病毒的感染和免疫系统研究,以及研制新型抗病毒疫苗或免疫佐剂等提供参考. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(045)012
【总页数】7页(P3479-3485)
【关键词】视黄酸诱导基因-Ⅰ (RIG-Ⅰ);家禽;天然免疫应答;抗病毒
【作 者】李雪峰;任梦婷;许丽文;王芳芳
【作者单位】东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030董育铭
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.4
天然免疫是指机体出生就具有的非特异性天然免疫防御功能，也称为非特异性免疫。天然免疫是机体抵御外来病原微生物侵袭的第一道防线，这种免疫应答关键在于能够限制包括病毒在内的多种病原体的早期感染和复制。当病毒感染宿主细胞后，天然免疫作用的启动还需特异性免疫系统的活化。这个过程要求宿主机体第一时间感知入侵的微生物，并将感
知信息传给某些免疫细胞。这一系列完整的信号传导是宿主细胞通过特定的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)监测到病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，从而激活机体的天然免疫应答，进而诱导Ⅰ型干扰素、促炎症细胞因子的表达。机体内这种模式识别受体主要分为：Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)、视黄酸诱导基因-Ⅰ样受体家族(RIG-Ⅰ like receptors，RLRs)、NOD样受体家族(NOD-like receptors，NLRs)和C型外源凝集素受体(CLRs)，目前的研究集中在TLRs和RLRs上。TLRs主要分布在树突状细胞，主要负责监测胞外病原微生物，而RLRs主要负责识别细胞质中病毒复制时所产生的双链RNA[1]。与TLRs相比，RLRs能够在各种被病毒感染的细胞内表达，可能在抗病毒天然免疫过程中起到更为关键的作用。因此，文章主要对家禽RIG-Ⅰ样受体的特性、抗病毒天然免疫信号通路，以及其在起机体抗病毒天然免疫应答中作用的进行综述，旨在为家禽抑制病毒的感染和免疫系统研究提供参考。
1 RIG-Ⅰ的结构与作用
2000年，Liu等[2]在利用视黄酸急性早幼粒细胞白血病时首次发现RIG-Ⅰ基因。Yoneya
ma等[3]研究发现，RIG-Ⅰ在监测到细胞质中的病毒RNA后能够诱导Ⅰ型干扰素的产生。RIG-Ⅰ全长约3.0 ku，编码一个由925个氨基酸残基构成的蛋白质。RIG-Ⅰ由两个N端半胱天冬酶激招募域(caspase activation and recruitment domain，CARD)、中央DExD/H盒解旋酶结构域和C端抑制结构域(RD结构域)组成。其中CARD作为RIG-Ⅰ的效应域，可促进RIG-Ⅰ与下游同样包含CARD结构域的分子相互结合作用，进而激活干扰素调节因子IRF-3、IRF-7的信号通路和NF-κB的入核通路。最终导致干扰素、炎性趋化因子、促炎因子等各种抗病毒基因的活化，从而抑制病毒的增殖和扩散。C端的RD结构域可使RIG-Ⅰ在监测不到病毒RNA时处于静息状态，中央的DExD/H解旋酶区域可结合ATP，在活化RIG-Ⅰ中起重要作用[4-6]。
RIG-Ⅰ能识别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、狂犬病病毒(SRV)、日本脑炎病毒(JEV)等，并诱导干扰素的产生，提高机体抵抗病毒的能力[7]。RIG-Ⅰ作为模式识别受体家族的新成员，其在抗病毒天然免疫中的重要作用已得到试验证实[8]。目前，对人、小鼠、猪等哺乳动物体内RIG-Ⅰ介导的抗病毒天然免疫的研究已较为明确，但对家禽体内RIG-Ⅰ的相关研究还处于初期阶段[7，9]。
2 家禽RIG-Ⅰ基因板式换热器选型
2.1 家禽RIG-Ⅰ的发现
家禽与哺乳动物的免疫系统不尽相同，与人相比，家禽缺失若干种干扰素(IFN)、白介素(IL)及肿瘤坏死因子(TNF)。因此，研究新的能够提高家禽天然免疫功能的抗病毒基因具有重要意义。Barber等[9]研究证实，鸡体内明显缺少RIG-Ⅰ基因。由此推测相对于鸭和鹅，AIV、NDV易感染鸡的原因可能是与缺少该基因有关。此外，Barber等[9]首次在鸭脾脏中分离鉴定得到鸭RIG-Ⅰ基因，并利用该基因瞬时转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1)，发现鸭RIG-Ⅰ基因能够与DF-1中的线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)聚合，并导致IFN-β诱导下游IFN刺激的抗病毒基因的表达。鸭RIG-Ⅰ的发现及其功能的应用，使RIG-Ⅰ成为家禽抗病毒天然免疫方面研究的热点基因。
2.2 家禽RIG-Ⅰ的结构与特性
鸭和鹅RIG-Ⅰ基因的结构与哺乳动物相似，但与人RIG-Ⅰ基因相比，某些起关键作用的氨基酸在鸭RIG-Ⅰ上不完全对应，且鸭RIG-Ⅰ的各个功能区域的氨基酸相对保守[10]。研究发现，鸭、鹅RIG-Ⅰ基因分别长2 802、2 805 bp，编码933和934个氨基酸[11-12]。鸭RIG-Ⅰ基因氨基酸序列与人和斑马雀的同源性分别为53%和78%[9]。而鹅RIG-Ⅰ基因氨基酸序列与人和
斑马雀的同源性分别为50.8%和78.1%[13]，鸭和鹅RIG-Ⅰ基因氨基酸序列同源性则高达93.8%[11]。Wang等[14]将北京鸭RIG-Ⅰ基因序列与其他物种进行了同源性比对分析，结果显示，RIG-Ⅰ基因在同一种属内保持高度保守，但不同物种间差异性较大。这一方面说明RIG-Ⅰ是某一种物种本身特有的天然免疫基因，另一方面也表明在不同物种间，天然免疫系统可能存在明显的差异。而这些差异也影响了宿主对不同病原微生物的易感性。Somani等[15]通过RT-PCR反转录得到鹅RIG-Ⅰ基因发现，RIG-Ⅰ C端RD结构域具有多态性，这也可能与禽类相关疾病的发病有关。
磨内喷水3 RIG-Ⅰ抗病毒天然免疫信号通路
RIG-Ⅰ样受体介导的抗病毒天然免疫信号通路大致可分为3个阶段：RIG-Ⅰ样受体在识别核酸配体前后的状态及激活下游的MAVS(①～③)；MAVS活化两条子通路，即NF-κB通路和IRF3/7通路(④～⑤)；产物的表达及效应(⑥)，具体通路见图1[16]。
图1 RIG-Ⅰ抗病毒天然免疫信号通路[16]Fig.1 Signaling pathway of RIG-Ⅰ innate antiviral immunity[16]
3.1 MAVS的激活
RIG-Ⅰ在正常细胞中以单体形式存在，在解旋酶结构域上，RIG-Ⅰ维持在封闭的自动抑制状态，当病毒侵犯机体细胞时，“非己”核酸被RIG-Ⅰ的C端结构域识别，随后RIG-Ⅰ被泛素化和ATP依赖性构象改变，生成单体或二聚体形式，随后在PACT、ZAPS、TRIM25等作用下移动到线粒体相关膜(MAM)上，与MAVS通过CARD-CARD结构相互作用将信号传导给下游[16-17]。MAVS又称IPS-1、VISA、CARDIF，是线粒体抗病毒信号接头蛋白，它在抗病毒天然免疫中起到关键的中枢作用[18]。MAVS由N端CARD结构域、中央富含脯氨酸的结构域(能够与一系列信号分子发生相互作用，如TRAF、TRADD等)及C端的跨膜区结构域3部分组成[19]。此外，RIG-Ⅰ也可被E3泛素化酶调节，其中TRIM25是一个重要的泛素连接酶，在与RIG-Ⅰ聚合后，可对其CARD结构域的K172赖氨酸残基进行K63连接的泛素化修饰，这一过程有利于RIG-Ⅰ与下游MAVS的结合及整个信号通路的活化转导，更有效的促进抗病毒因子的产生[20]。
泄漏率3.2 NF-κB与IRF3/7通路的活化
MAVS通过和TRAF2/3/6、TRADD、TANK等分子共同作用激活蛋白激酶IKK。IKK包括经典的IKK-α、IKK-β、IKK-γ(NF-κβ essential modulator，NEMO)。IKK-α、IKK-β、NEMO
等形成复合体能够磷酸化I κB，随后I κB被泛素化并被蛋白酶体降解，释放出有活性的NF-κB进入细胞核内，引起促炎症细胞因子表达[21]。此外，IKK还包括非经典的IKKε、TBK1等，可被结合后的MAVS与TRAF3招募并激活，活化后的IKKε、TBK1与TANK结合激酶协同作用，磷酸化IRF3和IRF7并以二聚体的形式进入细胞核，诱导干扰素的表达[17]。
3.3 产物的表达及效应
RIG-Ⅰ样受体信号通路最终不仅诱导IFN-Ⅰ和促炎症细胞因子等产物的表达，还能上调部分共刺激分子的表达水平，这些共刺激分子在T细胞活化机制中发挥作用。此外，IFN-Ⅰ还可激活其他通路，在诱导细胞凋亡、清除细胞内病毒等过程中发挥重要作用。促炎症细胞因子则可引起炎症反应、招募免疫细胞，诱导机体天然免疫应答的发生[22]。
菱角剥壳机
4 家禽RIG-Ⅰ的生物学特性
4.1 家禽RIG-Ⅰ的表达
研究发现，金定鸭RIG-Ⅰ基因在体内各个组织中表达情况不同，如其在鸭脾脏和肾脏中的表达量较高，在肝脏中呈中度表达，在心脏、肺脏、肌肉中表达量则较低[12，23]。Li等[13]
报道，RIG-Ⅰ基因在鹅正常组织中广泛表达，但也存在组织特异性，RIG-Ⅰ基因在1周龄小鹅肺脏、肝脏、脑和法氏囊中表达量最高，而在胸腺和肠道组织中表达量较低；Sun等[11]用实时荧光定量PCR检测鹅体内RIG-Ⅰ基因mRNA含量发现，RIG-Ⅰ存在于各组织中，并且在绝大多数组织中表达量较低，但在脾脏和肺脏中的表达量较高，感染NDV后，RIG-Ⅰ基因mRNA在法氏囊中的表达明显上调，并且伴随病毒滴度的降低；罗俊等[24]研究发现，RIG-Ⅰ基因在鸭胚胎不同时期的表达呈动态变化，并在法氏囊和胸腺中的表达量具有显著性差异；Cheng等[25]通过定量RT-PCR试验发现，番鸭RIG-Ⅰ基因mRNA在不同组织中广泛表达，特别是在黏膜组织中。RIG-Ⅰ基因表达可能因家禽日龄和品种等的不同而产生差异，但其广泛的表达证明该基因在动物体内起着重要的作用。
4.2 家禽RIG-Ⅰ的抗病毒作用研究
Kowalinski等[26]研究报道，双链RNA是激活RIG-Ⅰ基因的必要条件，反过来RIG-Ⅰ通过改变自身构象来识别病毒RNA；此外，病毒RNA的5′端三磷酸基团(5′ppp)在RIG-Ⅰ的识别过程中起重要作用。吴宁昭等[27]通过试验证实了RIG-Ⅰ可识别poly(I∶C)、5′ppp-dsRNA等病毒类似物，并通过荧光定量的方法发现poly(I∶C)和5′ppp-dsRNA感染鹅胚胎成纤维母细胞(GEF)
测斜管后，鹅RIG-Ⅰ基因mRNA水平分别上调4.1倍和17.3倍；Sun等[11]在HEK-293T中过表达鹅RIG-Ⅰ-full及RIG-Ⅰ-CARD，用5′ppp-dsRNA进行刺激发现，IFN-β的表达有所上调。这也表明RIG-Ⅰ通过识别病毒的5′ppp RNA来触发机体的天然免疫反应。
有研究证实，当鸭感染H5N1亚型AIV时，RIG-Ⅰ受体能够激活天然免疫信号的转导，并激活IFN-β的产生和下游抗病毒、抗炎症的相关基因的表达[28]；Barber等[29]利用鸭RIG-Ⅰ转染鸡细胞后感染禽流感病毒发现，RIG-Ⅰ的表达量显著上升并伴有病毒滴度的下降，诱导抗病毒天然免疫基因，包括Mx1、PKR、IFIT5、OASL、IFNB基因的上调及流感基质基因的下调，这也证实了鸭RIG-Ⅰ能够起到干扰素驱动的功能和针对流感的抗病毒免疫应答。此外，还有研究发现，H5N1亚型AIV能够诱导RIG-Ⅰ样受体的大量表达，且能促进人肺上皮细胞株A549培养液上清IFN-β的大量生成[30]；陈阳等[31]利用实时荧光定量PCR检测IFN-β、Mx1和PKR抗病毒基因的表达情况，证明鸭RIG-Ⅰ能通过N端CARD结构域引起鸡胚成纤维细胞RLR通路上抗病毒信号通路的诱导激活，显著上调鸡胚成纤维细胞中干扰素和抗病毒基因的表达；Barber等[9]研究表明，鸡体内因缺失一种RNA解旋酶，所以不存在RIG-Ⅰ基因。缺乏RIG-Ⅰ使鸡更容易感染AIV，临床症状比其他家禽更为突出；Cheng等[25]在体外试验中用番鸭RIG-Ⅰ质粒转染DF-1细胞，并用H9N2亚型AIV攻毒，结果显示，番鸭RIG-Ⅰ
的表达增强了干扰素的应答，抑制了病毒的复制并降低了病毒滴度，表明番鸭RIG-Ⅰ参与抗H9N2 亚型AIV天然免疫的早期阶段；Helin等[32]通过半自然感染技术，在接触低致病性禽流感病毒(LPAI)亚型H1N1后，发现野鸭体内的RIG-Ⅰ表达量在感染24 h内快速上调，但在感染后48 h恢复到基础水平，说明机体发生了强烈但较短暂的天然免疫应答。由于RIG-Ⅰ处于禽天然免疫级联的顶端，表明天然免疫应答在野鸭感染低致病性禽流感(LPAI)后能够提供较短暂的有效抑制作用；Shao等[33]研究表明，鸭RIG-Ⅰ能够诱导机体产生对抗AIV的天然免疫应答，在激活Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因，减少病毒ZB07的表达和复制，以及抑制病毒ZB07诱导的细胞凋亡方面都起到关键性作用。
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