收稿日期: 2017-01-22
基金项目: 江苏省林业三新工程项目(LYSX[2015]17)和江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)共同资助。
共同第一作者简介: 尤禄祥，高级工程师。E-mail ：496140746@qq ；谢梦梦，硕士研究生。E-mail: 983260360@qq * 通信作者: 王贤荣，教授。E-mail ：wangxianrong66@njfu.edu
安徽农业大学学报, 2017, 44(6): 1093-1097 Journal of Anhui Agricultural University
[DOI] 10.13610/jki.1672-352x.20171214.029 网络出版时间：2017/12/14 14:40:00 [URL] knski/kcms/detail/34.1162.S.20171214.1440.058.html
尤禄祥，谢梦梦，伊贤贵，王华辰，段一凡，王贤荣*
(南京林业大学生物与环境学院，南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京 210037)
摘 要：早樱种系（Cerasus subhirtella ）具有极高的观赏价值，变异丰富，在分类处理上也存在较多的
争议。以番茄为内标，用流式细胞仪对番茄和早樱种系相关材料的样品进行了基因组大小的测定。通过比较番茄与早樱不同材料样品峰值的倍数关系，计算出不同早樱样品的基因组大小。经多次试验测得大叶早樱（C. subhirtella ）基因组大小为（512.260 ± 16.200）Mb ，C 值（0.54 ± 0.289）pg ，野生早樱（C. subhirtella var. ascendens ）基因组大小为（274.360 ± 13.920）Mb ，即C 值为（0.28 ± 0.014）pg （以1 pg = 978 Mb 计算）。研究结果支持将野生早樱作为变种处理的分类观点。 关键词：流式细胞术；基因组大小；番茄；大叶早樱；野生早樱
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1672-352X (2017)06-1093-05
Study on the genome size of Cerasus subhirtella
YOU Luxiang, XIE Mengmeng, YI Xiangui, WANG Huachen, DUAN Yifan, WANG Xianrong
(Collaborative Innovation Center of the Southern Modern Forestry, College of Forest Resources and Environment,
Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)
Abstract: The group of Cerasus subhirtella has a high ornamental value with rich variations. Dispute分布式存储数据保护
s exist regarding its classification. In this experiment, taking tomato as an internal standard, we used flow cytometry (FCM) to determine the genome size of tomato and other samples of C. Subhirtella . By comparing the multiple relationship peak of tomato and other samples of C. subhirtella , the genome sizes of different C. subhirtella sam-ples were calculated. After several experiments, the results showed that the genome size of C. subhirtella was about (512.260 ± 16.200) Mb, C-value about (0.54 ± 0.289) pg. The genome size of C. subhirtella var. ascendens was (274.360 ± 13.920) Mb, C-value about (0.28 ± 0.014) pg (1 pg = 978 Mb). Such a difference in genome size supports that C. subhirtella var. ascendens is another variety.
Key words: flow cytometry; genome size; tomato; C. subhirtella ; C. subhirtella var. ascendens
来检测植物细胞中细胞核DNA 的含量[1]以及倍性水平[2]，DNA 的含量可以通过植物细胞的G1期的
数量，间接的反映植物细胞的倍性水平，因此通过
此方法可以获得植物的倍性分析。 C 值是生物体的单倍体基因组所含DNA 总量。其单位可以用质量 （pg ）表示，也可以用碱基对的数目（Mb ）来表示，之间的换算关系1 pg = 978 Mb 或1 Mb = 1.022×10-3 pg [3]。植物学家通过比较值物间
C 值的大小，对种进化、物种分类和生态学研究进
行相关分析，它是一种有用的分析工具和证据[4]。由于近缘物种的C 值极为相似，因此通过C 值获取基
因组大小，应用这一特征信息，分析物种之间的亲缘关系[5]，可以用来构建物种系统的进化树，也可以进一步来鉴定杂交物种。目前测定基因组大小的方
法有很多，通常使用Feulgen 分光光度法和流式细胞术。流式细胞术由于具有高效、快速和准确等方面的优点，因此可以用于测定植物的基因组大小[6]。 樱花是蔷薇科（Rosaceae ）樱属（Cerasus ）的植物，分布在全世界共200余种，樱花主要分布在
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北半球的亚洲、欧洲和北美的温暖地带，中国拥有的观赏类樱花资源丰富，大约有48种[7]。由于其变异丰富，因此分类处理争议较大，尤其是早樱种系，Miquel在1865年发表的Prunus subhirtella，为小乔木或灌木状，其高度为3～5 m，叶小，叶缘锯齿浅，齿尖有腺点，并且伴有二次开花的现象；2n = 24，为多倍体，杂交起源。1916年，Wilson把采自湖北襄阳的P. pendula var. ascendens Makino模式标本作为P. subhirtella的野生种处理，组合为变种P. sub-hirtella var. ascendens，主要区别在于野生
种为高大乔木，高5～20 m，小枝细密，叶较大，没有二次开花现象；2n = 16[8]。1997年王贤荣和向其柏将野生早樱处理为大叶早樱的变种，并补充了形态描述和地理分布[9]。《中国植物志》中英文版皆将其作为大叶早樱异名处理[10]，但在形态特征和地理分布方面的描述都比较模糊和矛盾，观点值得商榷。
目前在樱属植物的染体数目与核型的研究方面研究不多。其中，Oginuma认为樱桃的染体数目是不同的，其染体数为2n = 24、32[11]，而陈瑞阳认为樱桃的染体数目是2x、3x、4x，得到不同的染体倍性[12]。顾宇等[13]通过对樱属部分种进行核型分析研究，认为樱属植物的染体基数x = 8，有3种不同类型的染体数目：2n = 16、2n = 24和2n = 32。根据研究发现：二倍体2n = 2x = 16大多为野生种类，多倍现象主要是出现在经过人工栽培驯化的樱花种类[13]。李祯通过流式细胞术，初步对大叶早樱和野生早樱进行了倍性及基因组大小的研究测定[14]。但由于材料的准确性、实验结果的误差较大，为了提高实验结果的准确度，本研究进一步开展了对大叶早樱和野生早樱的实验。
本实验使用番茄作为内标植物，对大叶早樱和野生早樱的基因组大小通过流式细胞仪进行了测定分析，可以从细胞学研究结果上为分类处理提供了一定的理论依据，进而为樱属植物的全基因组测序提供了数据资料。
1 材料与方法
1.1 材料
大叶早樱和野生早樱的材料采于日本，使用其新鲜、健康的叶子进行流式细胞术，番茄由江苏省林业科学研究院提供。
1.2 方法
1.2.1细胞核悬液制备采集新鲜的樱花嫩叶10 mg，然后滴1 mL LB01在塑料培养皿中（见表1），然后用小刀片垂直、迅速的将其新鲜叶子切碎，除去尼龙网上的悬浮物，用400目的尼龙网过滤。将获得的滤液在4℃的离心机上设置转速1 000 r·min-1转离心10 min，用移液将上清液除去，然后收集沉淀于下方的植物细胞。采用同样方法获得番茄幼嫩叶片的细胞悬液，为了保持植物材料的新鲜，将实验材料放置于冰上进行。
表 1 7种细胞核裂解液的配方
Table 1 Component of seven nuclear lysis buffer
裂解液Lysis buffer
配方
Component
已测植物
Measured
plant
LB01 15 mmol·L-1 Tris，2 mmol·L-1Na2EDTA，0.5 mmol·L-1四盐酸精胺，80 mmol·L-1 KCl，
20 mmol·L-1 NaCl，15 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.1% Triton X-100，pH =7.5
蚕豆、番茄
Galbraith’s 45 mmol·L-1 MgCl2·6H2O，20 mmol·L-1 MOPS，30 mmol·L-1柠檬酸钠，0.1% Triton X-100，pH =7.0 松属、番茄Otto I 0.1 mmol·L-1柠檬酸，0.5% (V/V) Tween 20，20 mmol·L-1β-巯基乙醇，pH =2.3 瓠瓜Tris·MgCl2200 mmol·L-1 Tris，4 mmol·L-1 MgCl2·6H2O，0.5% TritonX-100，pH =7.5 矢车菊
Chopping 45 mmol·L-1 MgCl2，20 mmol·L-1 MOPS，30 mmol·L-1柠檬酸钠，0.1%Triton X-100，pH = 7.0 毛竹、酢浆草
GPB 0.5 mmol·L-1四盐酸精胺，30 mmol·L-1柠檬酸钠，20 mmol·L-1 MOPS，80 mmol·L-1 KCl，20 mmol·L-1
NaCl，0.5%Triton X-100，pH = 7.0
胡杨、豌豆
WPB 0.2 mmol·L-1 Tris-HCl，4 mmol·L-1 MgCl2·6H2O，2 mmol·L-1 Na2EDTA·2H2O，
86 mmol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1焦亚硫酸钠，1% PVP-10，1% Triton X-100，pH = 7.5
葡萄、垂柳、
虞美人
1.2.2 DNA特异性染将获得的樱花细胞核悬液和番茄细胞核悬液混合在一起，获得混合的细胞悬液。然后滴加入100 μL预冷的RNA酶在制备好的细胞核悬液中，同时加入500 μL预冷的PI染料，其中RNA酶和染料有效浓度为50 μg·mL-1，然后将材料置于放置于4℃的冰箱中，进行20～30 min避
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光染。
1.2.3 基因组大小的测定与计算 采用美国BD 公司Influx 的流式细胞仪对实验中的基因组大小进行检测分析。使其参数设定在488 nm 的激发光下，然后检测PI 的发射荧光强度。并且使每个待测样本至少收集1万个细胞，为了保证实验的准确性，每个样本重复测5次。一般来说变异系数（coefficient of variation ，CV ）控制在5%以内，但由于木本植物制备难道较大，CV 可控制在8%以内。测定所得的图像和数据由流式细胞仪自带的软件（BD FACS sortware 1.0.0.650 软件）进行数据处理。其中基因组大小计算公式如下：
DNA DNA =
⨯待测植物样品荧光强度
目标植物基因组大小内标植物样品荧光强度内标植物基因组大小
2 结果与分析
本实验中使用的PI 染料，是一种可以用于DNA 染的细胞核染试剂，可以在双链DNA 的碱基对中进行均匀的插入，并对细胞中的DNA 进行特异性染。将RNA 酶放入待测样品中，使细胞中的RNA 去除，因此PI 可以对细胞核中DNA 进行染。在实验中发现，细胞核中的DNA 含量与PI 的数量成正
比关系，因此DNA 中相对含量可以用荧光强度来表示。因而可以通过比较两者之间的荧光强度，来换算出其中的DNA 含量比例关系。
Leitch 等[15]分析基因组的大小变化基本趋势是基因组在增大，越古老的植物基因组越小。Narayan 和Rees [16]对山黧豆属（Lathyrus ）18个二倍体种的DNA 含量进行了分析研究，认为种间进化明显伴随有DNA 含量减少的趋势。Greilhuber [17]对百合科（Liliaceae ）绵枣儿属（Scilla ）18个二倍体种的研究也发现DNA 含量呈递减趋势。
邓果特等[18]测定了芒和荻的2C DNA 含量。芒2C DNA 含量为5.5 pg ，荻2C DNA 含量为4.5 pg 。五节芒、芒和荻都属于芒属，但五节芒与芒的亲缘关系更近，而与荻的亲缘关系较远，因此五节芒与芒的基因组大小较为接近，与荻的基因组大小差异较明显。周知里等[19]测定了木棉和瓜栗的 2C DNA 含量。测定结果表明：木棉的2C DNA 含量平均（1.55±0.03）pg ，瓜栗的2C DNA 含量平均（3.21 ± 0.075）pg 。从数据上可以看出，同为木棉科植物，瓜栗的基因组大小大约为木棉基因组大小的2倍。
本实验利用流式细胞仪对樱花细胞DNA 含量进行测定，每个材料进行5组重复试验（表2）。从
图1上可以看出樱花和番茄的基因组单独测定的结
果，番茄的基因组大小的测定峰（图1），与樱花的基因组大小测定峰（图2，图3）相互分开，没有
重叠，保证了用已知的基因组大小的番茄作内标，使樱花的基因组大小结果更为准确。通过对番茄和大叶早樱混合样品的PI 发射荧光强度的测定，结果分析（图4）表明，P3为大叶早樱2C DNA 含量峰，峰值为8 744，P4为番茄2C DNA 含量峰，峰值为15 830。对番茄和野生早樱混合样品的PI 发射荧光强度的测定，结果（图5）表明，P3为野生早樱2C DNA 含量峰，峰值为9 534，P4为番茄2C DNA 含量峰，峰值32 096。
利用流式细胞仪对樱花细胞DNA 含量进行测定，比较番茄样品与樱花样品峰值的倍数关系，可计算出樱花的基因组大小。大叶早樱基因组大小是番茄基因组大小平均值的（0.540 ± 0.017）倍，从而计算大叶早樱基因组大小为（512.260 ± 16.200）Mb ，即C 值为（0.540 ± 0.017）pg ；野生早樱基因组大小是番茄基因组大小平均值的（0.288 ± 0.147）倍，从而准确的计算出野生早樱的基因组大小为（274.360 ±13.920）Mb ，即C 值为（0.28 ± 0.014）pg （以1 pg DNA = 0.978×109 bp 计算）。
图 1 番茄样品C 值测试结果
Figure 1 The C-value measurement of tomato sample
图 2 大叶早樱样品C 值测试结果
Figure 2 The C-value measurement of C. subhirtella
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图 3 野生早樱样品C 值测试结果
Figure 3 The C-value measurement of C. subhirtella var . ascendens
图 4 大叶早樱与番茄混合样品C 值测试结果
Figure 4 The C-value measurement of the mixed samples of C. subhirtella and tomato
表 2 大叶早樱和野生早樱的基因组和C 值测试结果
Table 2 The different genome size and C-value of C. subhirtella and C. subhirtella var. ascendens
样品 Sample 样品峰值 Peak value of sample 番茄峰值 Peak value of tomato 样品峰值/番茄峰值
Peak value
of sample/tomato 样品基因组大小/Mb
Sample genome sizelrcp
C 值/pg C-value 8 744 15 830 0.552 524.40 0.536 大叶早樱 C. subhirtella
一次性奶茶杯
8 924 17 493 0.510 484.50 0.595 9 038 16 425 0.550 522.50 0.534 10 936 20 172 0.542 514.90 0.526 12 450
22 886 0.544 516.80 0.528 9 991 32 911 0.304 288.80 0.295 9 534 32 096 0.297 282.15 0.288 9 708 32 788 0.296 281.20 0.288 10 023 37 228 0.269 255.55 0.261 野生早樱
C. subhirtella var.ascendens
12 801
46 126
0.278
264.10
0.270
图 5 野生早樱与番茄混合样品C 值测试结果
Figure 5 The C-value measurement of the mixed samples of C. subhirtella var . ascendens and tomato
由此可以看出，大叶早樱C 值约为野生早樱的两倍，支持将野生早樱作为大叶早樱的变种处理。
3 结论
李祯通过比较不同樱属植物与大豆峰值大小的比较，得出结论：东京樱花基因组大小为320.71 Mb，
大岛基因组大小551.83 Mb ，八重红枝垂基因组大
小为274.59 Mb ，迎春樱基因组大小为336.83 Mb 等[14]。通过查阅植物C 值数据库得知：蔷薇科植物的C 值是0.1～3.65 pg ，其中苹果亚科C 值是1.09 pg ，绣线菊亚科C 值是0.47 pg ，蔷薇亚科C 值是0.61pg ，李亚科C 值是0.66 pg 。在本实验中，大叶早樱的基因组大小是（512.260 ± 16.200）Mb ，即C 值为（0.540 ± 0.017）pg ，野生早樱基因组大小是（274.360 ± 13.920） Mb ，即C 值为（0.28 ± 0.014）pg 。
Galbraith 等开创了利用流式细胞术来检测植物细胞中细胞核的DNA 含量以及其植物倍性的先 河[20]。邓果特等采用FCM 用水稻品种日本晴为内标，首次确定五节芒（M. floridulus ）的基因组大小平均为259.59 Mb [18]。武荣花等使用LB01裂解液检测出18个中国古老月季品种的基因组大小，其基因组大小在 0.62～0.71 pg 之间[21]。刘瑞瑞等使用流式细胞术检测出苦苣苔科的基因组大小，使用LB01裂解液所测物种中白花蛛毛苣苔的基因组最小[22]。李祯等以大豆品种William 82为标准样品，首次测
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定了山樱花（C. serrulata）的基因组大小为336.67 Mb。并得出LB01为最适樱属（Cerasus）植物细胞裂解[23]。
在本实验中，选用了多种裂解液，其中LB01裂解液最适合樱花的解离，LB01裂解液的细胞核悬浮液质量最好，碎片峰与样本峰可以明显的区分开来，WPB次之。出适合待测植物的裂解液，可以确保其植物的完整性，如果裂解液不适合，会使溶液粘稠，并且游离不出完整的细胞核。
Bennet和Leitch [24]内标的选择对流式细胞仪测定结果有着重要的影响。内标法是将待测样品与内标样品按一定的细胞数混悬在一起进行染，这种方法可以避免外标法引入的误差，可以使测量误差降低到最小限度。因而选取内标样本应满足：（1）已知内标样品的DNA含量，并且具有一定的稳定性；（2）待测样品与内标样品的染体结构相似；（3）待测样品与内标样品的峰值不能重叠。
本实验曾尝试使用模式植物水稻作为内标，由于客观上其基因组大小与樱花太过接近，测定混合样品樱花峰和水稻峰常会部分重叠，对实验结果的准确性造成一定的影响。理想的内标应选用与待测样品基因组大小比较相近、可以相互区分且容易获得的样品。
另外，用番茄做内标得到的粒子团区分明确清晰，表明采用番茄作为内标样品测定效果较好。因此，本研究以番茄作为内标来测定樱花基因组大小，结果更为准确可靠。
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