作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(8): 1926-1937 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail:***************
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.11067
王沙沙1黄超1汪庆昌1晁岳恩1,*陈锋2,*孙建国3宋晓4
1 河南省农业科学院小麦研究所 / 河南省小麦生物学重点实验室, 河南郑州 450002;
2 河南农业大学农学院 / 省部共建小麦玉米作
物学国家重点实验室 / 河南省粮食作物协同创新中心, 河南郑州 450002; 3 濮阳市农业农村局, 河南濮阳 457000; 4 河南省农业科学
院植物营养与资源环境研究所, 河南郑州 450002
摘要: 籽粒大小影响小麦粒重, 进而影响产量。目前, 对小麦籽粒大小相关基因的研究已有报道, 但其潜在的分子
机制尚不清楚。本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦籽粒大小相关基因TaGS2, 并对其序列进行生 物信息学分析。烟草亚细胞定位结果表明, TaGS2定位在细胞核和细胞质内。不同组织材料qRT-PCR分析表明, TaGS2
基因在小麦籽粒不同发育时期的表达量最高。构建TaGS2-PLGY-02-RNAi表达载体, 转化小麦。研究结果表明, TaGS2
基因在RNAi转基因小麦中表达量显著降低。RNAi转基因小麦的籽粒长度变短, 籽粒宽度变窄, 千粒重也降低。因
此推测TaGS2基因可能参与小麦籽粒大小或者千粒重的调控。本研究初步揭示了TaGS2基因功能, 并为小麦高产育
种中千粒重的提高提供重要的基因资源。
关键词：小麦; 籽粒大小; TaGS2基因; 亚细胞定位; 表达分析; RNAi干扰
Cloning and functional identification of TaGS2 gene related to kernel size in
muhdpe合金管
bread wheat
WANG Sha-Sha1, HUANG Chao1, WANG Qing-Chang1, CHAO Yue-En1,*, CHEN Feng2,*, SUN Jian-Guo3,
and SONG Xiao4
1 Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences / Henan Province Key Laboratory of Wheat Biology, Zhengzhou 450002,
Henan, China; 2 Agronomy College, National Key Laboratory of Wheat and Corn Crop Sciences / Collaborative Innovation Center of Henan Grain
Crops / Agronomy College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China; 3 Department of Agricultural and Rural Affairs of
Puyang, Puyang 457000, Henan, China; 4 Institute of Plant Nutrient and Environmental Resources, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zheng-
zhou 450002, Henan, China
Abstract: The kernel size affects kernel weight in wheat, and then affects yield. Up to date, the genes related to kernel size have
been reported in bread wheat. However, the underlying molecular mechanisms that regulates the size of wheat kernels remains
unclear. In this study, the TaGS2 gene related to kernel size was successfully cloned from bread wheat based on in silico cloning
and its sequence was analyzed by bioinformatics. Subcellular localization analysis of tobacco indicated that TaGS2 was localized
in the nucleus and cytoplasm. Relative expression levels of different tissues showed that the TaGS2 gene was highly expressed at
different developmental stages of the kernels. RNA interference vector TaGS2-PLGY-02-RNAi was constructed and transferred
into wheat. The results indicated that the relative expression levels of TaGS2 gene was significantly reduced in RNAi transgenic
wheat. In addition, the kernel length and width of RNAi transgenic wheat was shortened, and the thousand-kernel weight was
reduced as well. Therefore, it was speculated that TaGS2 gene was probably involved in the regulation of wheat kernel size or
thousand-kernel weight. This study preliminarily reveals the TaGS2 gene function and provides important genetic resources for
the improvement of thousand-kernel weight in wheat breeding program.
Keywords:Triticum aestivum L.; kernel size; TaGS2 gene; subcellular localization; expression analysis; RNAi interference
本研究由河南省青年科学基金项目(202300410527), 省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室开放课题(30500772)和国家青年科学基
金项目(31801261)资助。
This study was supported by the Henan Province Science Foundation for Youths (202300410527), the National Key Laboratory of Wheat and Maize
Crop Science in Henan Agricultural University (30500772), and the National Science Foundation for Young Scientists of China (31801261).
栅栏式接线端子*通信作者(Corresponding authors): 晁岳恩,E-mail:********************；陈锋,E-mail:***************
第一作者:E-mail:******************
Received (收稿日期): 2021-07-28; Accepted (接受日期): 2021-11-29; Published online (网络出版日期): 2021-12-22.
URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20211221.1223.006.html
第8期王沙沙等: 小麦籽粒大小相关基因TaGS2克隆及功能分析 1927
小麦是我国最重要的粮食作物之一, 它为人类提供50%的食物能量。随着人口数量的不断增长和耕地面积的逐年萎缩, 粮食需求日益增加, 而小麦总产量则难以有较大幅度的提高, 存在潜在的粮食安全隐患[1]。因此, 提高小麦单产和总产对我国经济发展具有重要意义, 同时也是我国小麦育种家长期追求的重要目标之一。
小麦产量主要由单位面积穗数、穗粒数和千粒重三要素决定。已有研究表明, 千粒重对小麦产量有重
要影响[2-4]。例如, 方学良[2]研究证实, 在合理穗数的基础上, 保持较高的每穗粒重, 有利于提高小麦产量。张煜[3]通过研究河南省小麦品种产量的遗传改进及相关生物学特性证实, 在河南省70年来小麦品种遗传改良过程中, 千粒重和穗粒数均有明显的提高, 其中千粒重的变化对产量水平的提高作用最大, 穗粒数次之, 而单位面积穗数在品种演变过程中始终保持相对稳定。由此可见, 千粒重对小麦产量的影响非常重要, 它主要由籽粒大小和籽粒灌浆程度来控制[4], 籽粒大小主要通过粒长、粒宽、粒厚影响小麦的千粒重, 最终影响小麦产量。因此, 从事籽粒大小的相关研究对小麦粒重改良有重要应用价值, 而开展小麦籽粒大小关键基因挖掘对进一步提高小麦产量意义重大。33链
在禾本科作物中, 水稻籽粒大小基因或者粒重基因的研究开始最早, 相关的作用机制也比较清楚, 其主要涉及以下几种途径: 包括通过由泛素介导的蛋白酶体(GW2和GW5/qSW5)降解、G蛋白信号途径(GS3和DEP1)、转录调控相关途径(GS2)、植物激素(TGW6、CKX2、GS6和Gnp4/LAX2), 还有其他未知途径(GS5和GW8)[5-16]。例如, GS2基因编码一个GRF4转录调控因子, 其编码序列一个突变(TC487-488AA突变)影响了microRNA (OsmiR396c)的结合位点, 从而导致GS2/OsGRF4表达量的升高。OsGS2表达量的增加导致水稻种皮体积增大、细胞数量增加, 从而提高籽粒重量和产量[15]。而小麦拥有庞大、复杂的基因组, 通过图位克隆的方法直接从小麦中克隆籽粒大小或者粒重相关基因非常困难。到目前为止, 在硬粒小麦[17]和六倍体小麦[18-19]中已鉴定出许多与籽粒大小或者粒重相关的QTL位点, 这些QTL位点几乎涵盖了小麦的所有染体(1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、4 D、5A和6B)[20-25]。根据基因的同源性和共线性, 比较基因组学为不同谷类作物之间克隆序列保守基因提供了可能[26]。利用此特性, 许多学者通过同源克隆的方法成功地从小麦中分离了一些籽粒大小相关基因[27-38]。例如, 负调控小麦粒宽和千粒重的TaGW2同源子首先得到广泛的研究[27-28]。而TaDA1基因(DA1-RELATED 1)作为小麦籽粒大小的负调控因子可与TaGW2相互作用影响小麦籽粒重量, 两者之间具有加性遗传效应[29]。随后又成功克隆了编码假定细胞分裂素氧化酶的基因TaCKX[24,30]、编码丝氨酸羧肽酶基因TaGS5[31-32]、与小麦淀粉合成有关的基因(TaAGP-S1和TaAGP-L)[33]、E3泛素连接酶基因TaSDIR1[34]。另外, 还有TaCYP78A3、TaGS3、TaGW7、TaGW8等基因[35-38]。研究结果表明, 这些基因均参与小麦籽粒大小或者粒重的调控。虽然上述基因已被克隆并具有功能特征, 但其潜在的分子机制尚不清楚。因此, 本研究拟克隆小麦籽粒大小相关基因TaGS2, 并通过亚细胞定位、qRT-PCR分析、转基因小麦(RNA干扰)等方面对其进行功能研究, 为解析小麦籽粒重量的分子机制提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
组织差异表达材料: 选取普通小麦露地栽培自然生长至三叶期幼苗的根、茎、叶、抽穗期的穗和小麦扬花后7、14、21、28、35和42 d 发育时期的种子, −80℃冻存。
转基因材料: 普通小麦JW1。RNAi载体PLGY-02 (山东省农业科学院作物研究所李根英研究员课题组提供)。
大田西瓜种植技术
1.2 总RNA的提取、反转录
利用TRIzol法提取中国春籽粒的总RNA。随后按照宝生物工程(大连)有限公司生产的第一链合成试剂说明书(TaKaRa Code No. RR047A)将其反转录获得cDNA, −20℃保存。
1.3小麦TaGS2基因的cDNA合成
根据水稻OsGS2基因(编号为Os02g0701300)序列, 通过中国春参考基因组2.0以及Ensemble Plants 进行同源Blast, 以此获得小麦籽粒大小相关基因Ta G S2及其c D N A序列。设计特异性引物(F: 5'-ATGGCGATGCCCTTTGCCT-3'; R: 5'-TTCACCTT CACCGGGAGTAT-3'), 以中国春cDNA为模板进行PCR扩增反应。PCR反应体系25 μL: 10 pmol μL–1上下引物各0.5 μL、基因组DNA 100 ng、10× Taq buffer (Mg2+ plus) 2.5 μL、dNTP (2.5 mmol L–1) 0.5 μL、
1928作物学报第48卷
Taq DNA聚合酶1.25 U, 灭菌的ddH2O将PCR反应体系补足至25 μL (以上所有试剂均购置于天根生化科技(北京)有限公司)。PCR扩增程序: 1) 预变性: 94 5 min; 2)
℃变性: 94 30 s,
℃退火: 60 80 s;
℃延伸: 72,
℃共35个循环; 3) 延伸: 72 7 min
℃。含溴化乙锭(EB)、浓度为1.0%~1.5% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离和检测。利用胶回收试剂盒(SK8131)进行目的片段的回收。将回收的目的片段连接至pMD18-T克隆载体上, 转化至DH5α感受态细胞中。单克隆菌落PCR检测, 筛选阳性克隆, 最终将含有目的片段的阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Chromos 2.4.3 (technelysium.au/?page_id=13)和FinchTV 1.5.0 (spiza/Products/finchtv.shtml)软件对测序结果进行可靠性检验和分析。选择测序正确的单克隆(TaGS2-2A-pMD18-T、TaGS2-2B- pMD18-T和TaGS2-2D-pMD18-T)进行细菌培养、提取质粒, −20℃保存。
1.4小麦TaGS2基因的生物信息学分析
为了更好地理解TaGS2蛋白的结构和功能, 利用SMART软件(bl-heidelberg.de/)及NCBI-CDD (bi.v/Structure/ i)预测该蛋白的信号肽及结构域; 利
用ProParam (/protparam/)分析小麦TaGS2编码氨基酸的数目、蛋白相对分子量、等电点等理化性质; 利用SPOMA (npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_o pma.html)在线分析软件预测其蛋白质二级结构; 利用TMHMM2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)在线软件预测TaGS2蛋白的跨膜区。
1.5小麦TaGS2蛋白的亚细胞定位
载体构建: 设计带酶切位点Bsa I/Eco 31I的特异性引物(F: 5'-CAGTGGTCTCACAACATGGCGAT GCCCTTTGCCTC-3'; R: 5'-CAGTGGTCTCATACAC CGGGAGTATATACCGTGGG-3'), 以测序正确的TaGS2-pMD18-T质粒为模板, 进行PCR扩增、测序。回收目的片段, 并将其连接至pBWA(V)HS-GLosgfp 载体上, 获得亚细胞定位载体pBWA(V)HS-TaGS2- GLosgfp。
转化、检测: pBWA(V)HS-TaGS2-GLosgfp重组质粒转入农杆菌GV3101。筛选、鉴定后制备侵染液。采用注射法将重悬农杆菌侵染入烟草叶片中, 48 h 后将其制作成玻片, 激光共聚焦荧光显微镜观察TaGS2亚细胞定位情况。1.6小麦TaGS2基因的表达模式分析
利用TRIzol法提取中国春根、茎、叶、穗和6个不同发育时期籽粒的总RNA。反转录获得cDNA。设计TaGS2-2A (F: 5'-TGGAAACGCAGCTCGTCT-3'; R: 5'-TCCATGTGCAGCTGAGCAGTA-3')、TaGS2-2B (F: 5'-AACTCATCCTTCTCACTCGCC-3'; R: 5'-GTT GCTGCTGTTGTTGGCA-3')、TaGS2-2D (F:
5'-ATGG GTTTAGGACTTCGGCG-3'; R: 5'-AGCTCGAGAGT GAGAACGC-3')以及小麦内参基因β-actin (F: 5'-CCAGCAATGTATGTCGCAATC-3'; R: 5'-AGCAT GAGGAAGCGTGTATC-3')的特异性引物。应用美国伯乐iQ5扩增仪进行实时荧光扩增。反应体系如下: 0.4 μL上下游引物(10 pmol)、10 μL SYBR Premix Ex Taq II (2×)、2 μL cDNA模板、灭菌ddH2O补足至20 μL。PCR程序: 94 2 min; 95 10 s, 60 10 s,
℃℃℃
72 20 s, 40
℃个循环; 72 10 min
℃。每个样品3次重复。采用2–∆∆CT方法分析TaGS2基因在各组织中的相对表达情况。
1.7转基因小麦TaGS2表达水平、表型分析
载体构建: 以TaS2-2A基因为主, 设计特异性引物, 验证该基因功能。具体操作如下: 根据TaGS2- 2A编码序列设计特异性引物(F: 5'-GGTACCACTAG TTTCGACGACGAC-3'; R: 5'-GGATCCGAGCTCC GGGAGTATATA-3'), 同时引入Bam H I、Kpn I、Spe I、Sac I 4个酶切位点。以测序正确的TaGS2-pMD18- T质粒为模板进行PCR扩增、测序、连接至pMD18-T 克隆载体上, 获得阳性克隆TaGS2-pMD
18-T。基因测序后, 酶切PLGY-02和TaGS2-pMD18-T质粒, 先用内侧酶Spe I/Sac I, 再用外侧酶Bam H I/Kpn I, 将目的片段正向和反向连接至PLGY-02载体上, 构建成RNAi载体TaGS2-PLGY-02-RNAi。
农杆菌转化获得转基因小麦: 采用农杆菌介导的方法对小麦品系JW1进行遗传转化, 获得转基因株系。
盲点监测系统
转基因小麦的阳性检测、qRT-PCR分析: 提取T1代转基因小麦的DNA, 设计含潮霉素抗性标记序列的特异性引物(HygF1: 5'-CGAGTACTTCTACACA GCCATC-3'; HygR1: 5'-GTCTGTCGAGAAGTTTCT GATCG-3'), 并对其进行PCR检测。之后提取T1代转基因阳性小麦和野生型籽粒的RNA, 反转录获得cDNA, 以β-actin为内参, 对小麦TaGS2基因进行qRT-PCR检测, 每个样品3次重复。
表型鉴定: 取自然成熟的T1代转基因阳性小麦和野生型小麦各10株, 调查其粒长、粒宽、千粒重
第8期
王沙沙等: 小麦籽粒大小相关基因TaGS2克隆及功能分析 1929
等性状。具体操作如Su 等的方法[27]: 每个单株随机选取10粒小麦种子, 将其分别按粒长、粒宽排成直线, 测量其总长度, 再取其平均值。之后每250粒称重, 重复2次, 取其平均数, 再折算成千粒重。
2 结果与分析
2.1 小麦TaGS2基因克隆、cDNA 序列的获得
根据已报道的水稻O s G S 2基因序列(Os02g0701300), 通过中国春参考基因组 2.0和EnsemblPlants
进行同源Blast, 我们成功获得水稻 OsGS2基因在小麦中的3个contigs (gnl| IWGSC_2AL|IWGSC_chr2AL_ab_k71_contigs_longer than_200_6436040_3487_31186_6297589-1578075+3385503+、gnl|IWGSC_2BL| IWGSC_chr2BL_ab_k71_ contigs_longerthan_200_8058666_15761_598280_ 6234326gnl|IWGSC_2DL|IWGSC_chr2DL_ ab_k71_contigs_longerthan_200_9834732_7538_9810155+), 并将其分别命名为TaGS2-2A 、TaGS2-2B 和TaGS2-2D (附图1), 其基因
组DNA 全长分别为3178、3251和3331 bp 。序列分析发现, 这3个基因均由4个外显子和3个内含子组成(图1), 其编码序列长度分别为1155、1164和1176 bp, 编码384、387和391个氨基酸。以中国春总RNA 反转录获得的cDNA 为模板, PCR 扩增、目的片段回收, 并将其连接到pMD18-T 克隆载体上, 测序, 最终获得小麦TaGS2-2A 、TaGS2-2B 和TaGS2- 2D 的cDNA 序列。
2.2 小麦TaGS2基因的生物信息学分析
通过NCBI-CDD 在线软件预测表明, 小麦TaGS2蛋白包含GRF (growth-regulating factor 4)家族特有的2个结构域: 一个为QLQ (58~94氨基酸), 另一个为WRC (121~163氨基酸) (图2-A)。生物信息学分析表明, TaGS2蛋白分子量为42.3 kD, 理论等电点pI 为6.76, 为亲水性蛋白。蛋白二级结构由4种形式构成(
图2-B), 包括α螺旋27.08%、延伸链4.95%、β转角3.12%、无规则卷曲64.84%。该蛋白无信号肽, 无跨膜结构区(图2-C)。
图1 小麦TaGS2基因结构图
Fig. 1 Schematic representation of the structures of TaGS2
gene in bread wheat
图2 小麦TaGS2基因生物信息学分析
Fig. 2 Bioinformatics analysis of TaGS2 gene in wheat
A: 结构域预测; B: 蛋白二级结构预测; C: 跨膜结构预测。
A: domain prediction; B: protein secondary structure prediction; C: transmembrane structure prediction.
1930
作 物 学 报 第48卷
煤气化炉2.3 TaGS2蛋白的亚细胞定位
构建瞬时表达载体pBWA(V)HS-TaGS2-GLosgfp 并转化烟草叶片的表皮细胞, 通过融合蛋白GFP 荧光显示TaGS2蛋白的亚细胞定位。其结果显示, 注射含有空载体pBWA(V)HS-GLosgfp 质粒菌株的烟草叶片在细胞核、细胞质和细胞膜均有绿荧光, 而注射含有目的基因pBWA(V)HS-TaGS2-GLosgfp 质粒菌株的烟草叶片在细胞核和细胞质中有绿荧光(图3), 说明TaGS2蛋白定位于细胞核和细胞质内。 2.4 小麦TaGS2基因的表达模式分析
对中国春小麦不同组织材料进行qRT-PCR 检测, 其结果表明TaGS2的3个同源基因在小麦根、叶、茎、穗及不同发育时期的籽粒中均表现相似的表达模式, 但是在小麦籽粒不同发育时期的表达量
高于其根、茎、叶及穗中的表达量。小麦TaGS2的3个同源基因在籽粒不同发育时期的表达模式分析显示, 这3个同源基因均表现先低后高再低的表达趋势, 即TaGS2-2A 和TaGS2-2D 基因在小麦扬花后2
8 d 表达量最高, TaGS2-2B 基因在小麦扬花后35 d 表达量最高。因此推测TaGS2基因可能参与小麦籽粒大小或者粒重的调控(图4)。因3个同源基因在小麦不同组织中的表达模式相似, 随后以TaGS2-2A 基因为主, 通过农杆菌转化研究该基因功能。
2.5 转基因小麦的PCR 检测
提取T 1代RNAi 转基因小麦和野生型小麦叶片DNA 进行PCR 检测, 野生型无目的条带, 其他14株转基因小麦均检测到潮霉素抗性标记(图5)。
图3 小麦TaGS2蛋白的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of TaGS2
protein in wheat
图4 小麦TaGS2基因同源子不同组织材料的表达模式
Fig. 4 Relative expression levels of TaGS2 homoeologous in different tissues of wheat
图5 转基因小麦的PCR 检测
Fig. 5 PCR detection of transgenic plants in wheat
M: DL2000 marker; 1~14: T 1代转基因植株; 15: 野生型小麦。 M: DL2000 marker; 1–14: T 1 transgenic plants; 15: wild-type wheat.
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