作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(5): 1222 1234 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@caas
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14060
椰油酸肖健1陈思宇1孙妍1杨尚东1,*谭宏伟2,*
1广西大学农学院, 广西南宁 530004; 2广西农业科学院 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西南宁 530007
摘要: 分析不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌落结构特征, 旨在解析不同施肥水平对甘蔗植株内生细菌
落的影响, 为挖掘和利用有益内生细菌及其功能提供理论依据。结果发现, 门分类水平, 施肥处理条件下甘蔗植株根
系中放线菌门(Actinobacteria)细菌丰度占比均低于相应的不施肥处理, 但绿弯菌门(Chloroflexi)细菌丰度占比均高于
不施肥处理。属分类水平, Haliangium、Acidicapsa、unclassified_f__Ktedonobacteraceae和unclassified_f__
Acidobacteriaceae_Subgroup_1是常规施肥水平(3000 kg hm–2, H处理)条件下甘蔗植株根系特有的优势内生细菌属;
而鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是减量施肥水平(1500 kg hm–2, M处理)下特有的优势内生细菌属; 中慢生根瘤菌属
(Mesorhizobium)、norank_f__BIrii41、糖霉菌属(Glycomyces)、norank_f__67-14、Reyranella、unclassified_f__
Steroidobacteraceae、unclassified_f__Xanthobacteraceae和norank_f__Roseiflexaceae、Dongia是低施肥水平处理(300 kg
hm–2, L处理)甘蔗植株根系特有的内生细菌优势菌属; 柄杆菌属(Caulobacter)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)、诺卡氏
菌属(Nocardia)、Kitasatospora、norank_f__norank_o__norank_c__Actinobacteria、Oceanibaculum和拟无枝菌酸菌属
(Amycolatopsis)是不施肥水平(CK)条件下甘蔗植株根系中特有的内生细菌优势属。基因功能预测结果显示, 与不施肥
处理相比, 施肥不仅影响甘蔗植株根系内生细菌落组成, 而且影响植株根系内生细菌的代谢功能; 但不同施肥水csi lv
平处理之间, 依施肥量的多少对甘蔗植株根系内生细菌落组成影响存在显著差异。与常规施肥相比, 减量施肥
(1500 kg hm–2)处理不仅没有导致甘蔗产量显著降低, 而且没有显著改变常规施肥条件下甘蔗植株内生细菌的落组
成和代谢功能, 完全可替代常规施肥进行施肥管理。
关键词：甘蔗; 减量施肥; 内生细菌; 高通量测序
Characteristics of endophytic bacterial community structure in roots of sugar-
褐变度cane under different fertilizer applications
XIAO Jian1, CHEN Si-Yu1, SUN Yan1, YANG Shang-Dong1,*, and TAN Hong-Wei2,*
1 Agricultural College, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China;
2 Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement /
Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, Guangxi, China
Abstract: To explore the beneficial endophytic bacteria in sugarcanes and their functions, we analyzed the characteristics of
endophytic bacterial community structure in roots of sugarcane under different fertilizer applications. At the phylum level, the
proportion of Actinobacteria in roots of sugarcanes under different fertilization levels were lower than that in the control. However,
the proportion of Chloroflexi in roots of sugarcanes under different fertilization levels applications were higher than that in CK. At
本研究由国家重点研发计划项目(2020YFD1000505), 国家自然科学基金项目(31760368), 广西壮族自治区农业科学院广西甘蔗遗传改良重
点实验室开放课题(16-K-04-01), 国家现代农业产业技术体系建设专项(甘蔗宿根栽培, CARS170206), 广西创新驱动发展专项(桂科
AA17202042)和广西甘蔗产业创新团队甘蔗栽培岗资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2020YFD1000505), the National Natural Science
Foundation of China (31760368), the Guangxi Zhuang Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences Guangxi Sugarcane Genetic Improve-
ment Key Laboratory Open Project (16-K-04-01), the China Agricuture Research System (Sugarcane Host Cultivation, CARS170206), the Guangxi
海马ゆう
Innovation-Driven Development Special Project (Guike AA17202042), and the Guangxi Sugarcane Industry Innovation Team Sugarcane Cultivation
Post.
* 通信作者(Corresponding authors): 杨尚东, E-mail: ysd706@gxu.edu; 谭宏伟, E-mail: hongwei_tan@163
第一作者: E-mail: 1318513279@qq
Received (收稿日期): 2021-04-13; Accepted (接受日期): 2021-07-12; Published online (网络出版日期): 2021-08-03.
URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20210802.1609.002.html
第5期肖健等: 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌落结构特征 1223
the genus level, Haliangium, Acidicapsa, unclassified_f__Ktedonobacteraceae, and unclassified_f__Acidobacteriaceae_ Subgroup_1 were the specific dominant endophytic bacterial genera in root of sugarcanes under conventional fertilization level (3000 kg hm–2, H treatment); while Sphingomonas was the specific dominant endophytic bacterial genus in roots of sugarcanes under fertilization level (1500 kg hm–2, M treatment); Mesorhizobium, norank_f__BIrii41, Glycomyces, norank_f__67-14, Reyra-nella, unclassified_f__Steroidobacteraceae, unclassified_f__Xanthobacteraceae, norank_f__Roseiflexaceae, and Dongia were the specific dominant endophytic bacterial genus in roots of sugarcanes under the fertilization level (300 kg hm–2, L treatment). On
the contrary, Caulobacter, Pseudonocardia, Nocardia, Kitasatospora, norank_f__norank_o__norank_c__Actinobacteria, Oce-anibaculum, and Amycolatopsis were the unique dominant endophytic bacterial genera in root of sugarcane without fertilization application (control). And Actinospica, Catenulispora, Acidothermus, Dyella, and norank_f__Xanthobacteraceae were lost in root
of sugarcanes under low nitrogen applications. Gene function prediction also revealed that, compared to no-fertilization treatment, both the endophytic bacterial community structure and the metabolic functions of endophytic bacteria in roots of sugarcanes were affected by different fertilizer applications. However, the structures of endophytic bacterial community in roots of sugarcane were significant differences among different fertilization treatments depending on the amounts of fertilizer applications. Compared to conventional fertilization, the yields of sugarcanes, and the structure, metabolic function of endophytic bacteria in roots of sugar-canes were not significantly changed by fertilizer application under 1500 kg hm–2 treatment. In conclusion, the conventional fertilization at the present stage can be substituted by reducing fertilizer application from 3000 kg hm–2 to 1500 kg hm–2 level in sugarcane.
Keywords: sugarcane (Saccharum L.); reduced fertilization; endophytic bacteria; high-throughput se
quencing
甘蔗(Saccharum L.)是一种重要的糖料作物, 世界范围内被广泛用于生物燃料和可再生生物质能源[1]。中国是仅次于巴西和印度的世界第三大产糖国家, 在世界甘蔗产业中占据着重要的地位。广西是自1993年以来中国最大的甘蔗生产和制糖省份, 占全国糖产量的65%以上[2]。与其他地区相比, 广西甘蔗产量偏低的问题仍制约着我国蔗糖产业的国际竞争力。众所周知, 化肥的施用对提高作物产量, 确保国家粮食安全具有重要的意义[3]。面对人口的日益增长, 大量的化肥被施入农田以获得更高的作物产量, 化肥投入量往往大于作物对养分的需求[4], 近年来, 为了提高甘蔗产量, 我国甘蔗生产中普遍存在大量且盲目地施用化肥。其中, 氮肥每年施用量高达600~ 800 kg hm–2, 而产糖大国巴西的新植蔗施用量仅为60 kg hm–2, 宿根蔗的施用量为80~120 kg hm–2 [5]。我国甘蔗生产中氮肥的施用量约是产糖大国巴西的10倍。化肥过量施用不仅无助于提高作物产量, 而且还会引起环境污染, 不利于农业的可持续发展[3]。研究已证实, 过量施用氮肥不利于提高甘蔗产量而且降低肥料利用率, 导致甘蔗的糖分、视纯度和重力纯度下降, 影响甘蔗的品质[6]。同时, 长期过量施用氮肥不仅会造成农业资料的浪费, 还会造成养分流失, 对农业生态环境造成严重威胁[7-9]。减量施肥正是在这种背景下发展起来的养分管理技术, 即在保证作物产量稳定的前提下, 减少肥料投入, 以提高肥料利用率、降低环境污染[3]。郭强等[10]研究发现, 减量施肥对甘蔗产量、农艺性状、品质、蔗糖量、土壤养分含量等方面均没有显著影响。近年来, 针对化肥减量施用的研究主要集中在土壤理化性质、氮素平衡、作物产量和土壤微生物落等方面[11]。然而, 减量施肥的程度以及减量施肥对植株内生细菌落结构影响的相关研究仍鲜见报道。
植物内生细菌是一类生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的微生物, 与宿主植物关系密切[12]。内生细菌具有溶磷、解钾、固氮等作用以及产生铁载体、抗菌活性物质和植物生长激素等作用, 具有促进宿主植物生长、营养物质积累和提高抗逆性(抗病虫害、高温、盐碱或干旱等)功能[13]。
为此, 本文分析不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌落结构特征, 旨在解析甘蔗植株根系内生细菌落结构对不同施肥水平的响应机制, 为甘蔗实际生产中科学合理的减量施肥提供理论依据和参考。
1材料与方法
1.1试验地概况
广西农业科学院甘蔗研究所隆安丁当试验基地(23°6′22″N, 107°59′5″E)试验地土壤类型为赤红壤, pH 5.1, 含有机质21.4 g kg–1、全氮1.11 g kg–1、全磷0.71 g kg–1、全钾8.6 g kg–1、碱解氮96.5 mg kg–1、速效磷12.3 mg kg–1、速效钾156.5 mg kg–1。
1.2试验材料
供试甘蔗品种为桂糖49号, 由广西农业科学院甘蔗研究所提供。该品种需肥特点中等, 适宜在中等肥力以上的水田和旱地种植。供试肥料为史丹利牌硫酸钾型45%复合肥(N∶P2O2∶K2O=15∶15∶
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15, 史丹利化肥股份有限公司生产), 购于南宁市农资市场。
1.3试验设计
试验于2018—2020年进行, 调查当地农民前3年施肥习惯进行加权平均, 参考当地施肥水平, 采用随机区组设计4种不同施肥模式。分别为: 不施肥水平(CK)为空白对照; 常规施肥水平(3000 kg hm–2, H处理)为复合肥(N∶P∶K = 15∶15∶15) 3000 kg hm–2; 减量施肥水平(1500 kg hm–2, M处理)为复合肥(N∶P∶K = 15∶15∶15) 1500 kg hm–2; 低施肥水平(300 kg hm–2, L处理)为复合肥(N∶P∶K = 15∶15∶15) 300 kg hm–2。除施肥水平差异外, 其余常规田间管理措施均相同。每种施肥模式为1个试验处理, 共4个处理, 每个处理设3个重复, 共12个小区, 每个小区5行, 行长7 m, 甘蔗栽培行距1.8 m, 小区面积63 m2。试验地用大型拖拉机犁耙整地开行后于每年3月种植甘蔗。同时, 收获时按常规方法分别对2018—2020年不同施肥水平处理的甘蔗进行称重测产。
1.4样品采集
于2020年6月18日随机采集不同施肥水平处理下的甘蔗植株样品进行分析。采集甘蔗植株样品时, 用75%乙醇喷洒铁铲进行消毒, 在每种不同施肥处理下随机选取3株长势一致的甘蔗植株, 然后以蔗茎为
中心(直径约60 cm)挖深度约40 cm, 形成疏松、环形的根际圈。然后手握植株茎基部用力将整个植株连根带土拔起, 抖掉附着在根部的土壤, 标记后装入无菌密封袋放入放置有冰袋的冰盒带回实验室。无菌水冲洗植株表面的附着物并用无菌滤纸吸干, 然后用75%乙醇喷洒剪刀消毒后采集植株根系样品, 送样检测植株根系内生细菌。
1.5植株内生细菌多样性分析
由上海美吉生物医药科技有限公司完成根系样品总DNA提取、PCR扩增和序列测定[14-15]。
1.5.1 DNA抽提和PCR扩增根据FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, U.S.)说明书进行总DNA抽提, 使用NanoDrop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, U.S.)检测DNA浓度和纯度, 并以提取的植物内生微生物DNA为模板, 选择799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3')和1192R (5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3')引物对V5~V7可变区进行第1轮PCR扩增, 选择799F (5'-AACMG GATTAGATACCCKG-3')和1193R (5'-ACGTCATCC CCACCTTCC-3')引物对V5~V7可变区进行第2轮PCR扩增。在ABI GeneAmp 9700上进行PCR扩增。
1.5.2 Illumina Miseq测序将同一样本的PCR 产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosci-ences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用Quantus Fluorometer (Promega, USA)对回收产物进行定量检测。使用NE
XTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库: (1) 接头链接; (2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段; (3) 利用PCR扩增进行文库模板的富集; (4) 磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的MiseqPE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。
1.5.3 数据处理使用软件Trimmomatic对原始测序序列进行质控, 使用软件FLASH进行拼接, 设置50 bp的窗口, 去除质控后长度低于50 bp的序列, 根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接, 根据序列首尾两端的barcode和引物将序列拆分至每个样本, 使用软件UPARSE (version 7.1 drive5. com/uparse/)根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体, 生成OTU表格, 利用RDP classi-fier (su.edu/)对每条序列进行物种分类注释, 比对Silva数据库(SSU123), 设置比对阈值为70%。获得分类学信息和各个样本在各分类水平上的落组成, 用图形进行可视化表示, 使用软件Usearch和Mothur分别计算OTU丰度和Alpha多样性, 得到样品物种信息。
1.6统计分析
采用Microsoft Excel 2019进行数据计算, IBM SPSS Statistics 21统计软件进行方差分析, Duncan’s 法进行显著性检验(P<0.05), 并利用上海美吉生物医药科技有限公司的I-sanger云数据分析平台进行在线数据分析。平均数据以“平均数±标准差(SD)”表示。
2结果与分析
2.1不同施肥水平对甘蔗产量的影响
由表1可知, 2018年, 常规施肥水平(3000 kg hm–2)处理甘蔗产量最高, 达111.09 t hm–2; 减量施肥水平(1500 kg hm–2)处理甘蔗产量为107.78 t hm–2, 虽略低于常规施肥处理, 但两者间差异不显著; 低施肥水平(300 kg hm–2)处理和不施肥水平处理甘蔗
第5期
肖健等: 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌落结构特征 1225
产量分别为61.21 t hm –2、56.41 t hm –2, 均显著低于常规和减量施肥处理; 2019年, 常规施肥水平处理甘蔗产量同样呈现最高, 达114.15 t hm –2; 减量施肥水平(1500 kg hm –2)处理甘蔗产量为106.60 t hm –2, 虽低于常规施肥水平处理, 但同样地两者间差异不显著; 低施肥水平(300 kg hm –2)和不施肥水平处理
甘蔗产量分别为64.29 t hm –2、58.02 t hm –2, 亦显著低于常规和减量施肥处理; 2020年, 不同施肥处理条件下, 甘蔗产量亦呈现相同的变化趋势(表1)。基于2018—2020年甘蔗产量数据, 与常规施肥处理相比, 减量施肥水平(1500 kg hm –2)处理甘蔗产量没有发生显著变化。
表1 不同施肥水平下甘蔗产量
Table 1 Yields of different fertilization levels in sugarcane (t hm –2)
产量Yield 样本 Sample name
2018 2019 2020
CK 56.41±2.59 b 58.02±5.32 b 53.95±5.87 b H 111.09±2.69 a 114.15±5.21 a 108.04±11.22 a M 107.78±6.92 a 106.60±2.68 a 99.24±5.36 a L
61.21±4.13 b
64.29±4.05 b
60.79±7.10 b
表中数据为平均值±标准差。数据后不同小写字母表示不同施肥水平下甘蔗产量之间差异显著(P < 0.05)。CK: 不施肥水平; H: 常规施肥水平(3000 kg hm –2); M: 减量施肥水平(1500 kg hm –2); L: 低施肥水平(300 kg hm –2)。
Data in the table are means ± SD. Values followed by different lowercase letters mean significant diff砂浆机
erence between the yields under differ-ent fertilization levels at P < 0.05 in sugarcane. CK: without fertilization application; H: conventional fertilization level (3000 kg hm –2); M: reduced fertilization level (1500 kg hm –2); L: low fertilization level (300 kg hm –2).
2.2 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌
视力保护器OTU 聚类分析
由表2可知, 不同施肥水平下, 甘蔗植株根系内生细菌落聚类分析共获得20门、40纲、105目、184科、338属、565种、963个OTU (Operational Taxonomic Units)的分类水平。其中, 不施肥水平(CK)下, 甘蔗植株根系内生细菌分类水平为14门、26纲、73目、110科、185属、276种和406 OTU, 与之相比, 常规施肥水平(H 处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌分类水平为18门、34纲、84目、138科、231属、372种和569个 OTU, 减量施肥水平(M 处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌分类水平为19门、31纲、84目、136科、234属、362种和570 OTU; 低施肥水平(L 处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌分类水平为20门、35纲、93目、152科、266属、419种和641 OTU 。表明, 不同施肥水平均改变了
甘蔗植株根系不同分类水平内生细菌落的组成。与不施肥水平(CK)相比, 不同施肥水平均不同程度地提高了甘蔗植株根系内生细菌不同分类水平的数量目。
2.3 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌Alpha 多样性分析
基于云平台分析不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌的丰富度和多样性指数。其中, 以Shannon [16]和Simpson 指数[17]指示内生细菌的多样性, Chao1[18]和Ace 指数[16]指示内生细菌的丰富度。Chao1、Ace 和Shannon 指数越大, Simpson 指数越小, 说明样品的物种丰富度和多样性越高[19]。由表3可知, 与不施肥水平(CK)相比, 不同施肥水平均显著提高了甘蔗植株根系内生细菌的多样性和丰富度指数, 但不同施肥水平之间, 甘蔗植株根系内生细菌多样性和丰富度指数之间均无显著差异。
表2 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌不同分类水平数量
Table 2 Numbers of different taxonomic levels of endophytic bacteria under different fertilization levels in sugarcane
不同分类阶元归类数量 Number of different taxonomic categories
样本 Sample 分类操作单元数量 Number of operational taxonomic units (OTU)
门 Phylum
纲 Class
目 Order
科 Family
属 Genus
种 Species
CK 406 14 26 73 110 185 276 H 569 18 34 84 138 231 372 M 570 19 31 84 136 234 362 L
641 20 35 93 152 266 419 总计 Total
963
20 40 105 184 338 565
样本缩写同表1。Abbreviations of sample are the same as those given in Table 1.
1226作物学报第48卷
表3不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌Alpha多样性
Table 3 Alpha diversity of endophytic bacteria in root of sugarcane under different fertilization levels
样本Sample name
香农指数
Shannon index
辛普森指数
Simpson index
ACE指数
ACE index
Chao1指数
Chao1 index
CK 3.41±0.02 c 0.082±0.012 a 414.08±29.20 b 309.04±19.74 b
H 4.05±0.06 ab 0.039±0.001 b 522.80±9.85 a 538.11±8.83 a
M 4.45±0.12 a 0.030±0.003 b 584.38±34.07 a 545.31±4.66 a
L 4.20±0.06 ab 0.046±0.017 ab 507.29±12.03 a 460.50±82.69 a
表中数据为平均值±标准差。数据后不同小写字母表示不同施肥水平下甘蔗植株根系之间差异显著(P < 0.05)。样本缩写同表1。
Data in the table are means ± SDs. Values followed by different lowercase letters mean significant difference between the root systems under different fertilization levels at P < 0.05 in sugarcane. Abbreviations of sample are the same as those given in Table 1.
2.4落组成分析
2.4.1 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌优势落门分类水平门分类水平, 不同施肥水平甘蔗植株根系中, 丰度占比大于1%的优势内生细菌门分类水平数量均为4个, 分别为变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)细菌(图1)。但不同施肥水平下, 甘蔗植株根系内生细菌优势菌门丰度组成占比存在如下差异。其中, 不施肥水平(CK)下, 甘蔗植株根系内生细菌优势菌门占比大小依次为: 变形杆菌门(Proteobacteria, 58.57%) > 放线菌门(Actinobacteria, 36.87%) >酸杆菌门(Acidobacteria, 2.88%) >绿弯菌门(Chloroflexi, 1.09%)
以及其他(others)门类占比小于1%; 与之相比, 常规施肥水平(H处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌优势菌门占比大小依次为: 变形杆菌门(Proteobacteria, 48.89%) > 放线菌门(Actinobacteria, 34.60%) > 酸杆菌门(Acidobacteria, 8.66%) > 绿弯菌门(Chloroflexi, 5.54%)和其他(others)门类占比2.31%; 减量施肥水平(M处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌优势门分类水平占比大小依次为: 变形杆菌门(Proteobacteria, 6
3.11%) >放线菌门(Actinobacteria, 21.71%) > 酸杆菌门(Acidobacteria, 6.71%) > 绿弯菌门(Chloroflexi, 5.47%)以及其他(others)门类占比 3.00%; 低施肥水平(L处理)下, 甘蔗植株根系内生细菌优势门分类水平占比大小依次为: 变形杆菌门(Proteobacteria, 7
4.33%) > 放线菌门(Actinobacteria, 19.22%) > 绿弯菌门(Chloroflexi, 3.80%) > 酸杆菌门(Acidobacteria, 1.30%)以及其他(others)门类占比1.36%。
与不施肥水平(CK)相比, 不同施肥水平均不同程度地增加了其他(others)菌门的丰度占比; 此外, 除低施肥水平中改变了甘蔗植株内生细菌优势菌门中绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)细菌的丰度占比大小顺序外, 常规施肥或减量施肥水平中, 甘蔗植株根系优势内生细菌门丰度占比顺序均与不施肥处理(CK)一致。表明减量施肥并没有改变甘蔗植株内生细菌门分类水平丰度占比的大小顺序, 但低施肥水平则改变了甘蔗植株优势内生细菌门丰度占比的大小顺序。
2.4.2 不同施肥水平下甘蔗植株根系内生细菌优势落属分类水平属分类水平, 不同施肥水平下, 甘蔗植株根系中占比大于1%的优势内生细菌属数量及丰度占比如图2所示。其中, 常规施肥、减量和低施肥水平与不施肥处理中, 优势细菌属的数量分别为19、16、19和18个。
(图1)
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