Hereditas (Beijing) 2021年3月, 43(3): 215―225 www.chinagene
收稿日期: 2020-11-25; 修回日期: 2021-01-18
基金项目:
国家自然科学基金项目(编号：31801973,31772884)，大连市支持高层次人才创新创业项目(编号：2019RQ126)，国家重大基础研究 发展规划(973)计划课题(编号：2013CB835304)，全国海洋公益项目(编号：201305016)，辽宁省海洋与渔业厅科研项目(编号：201805)和大连市科技创新基金项目(编号：2018J12SN079)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31801973, 31772884), Dalian Supports Innovation and Entrepreneurship Projects of High Level Talents(No. 2019RQ126), the Chinese Major S
tate Basic Research Development Program (973) (No. 2013CB835304), the Marine Public Welfare Project of the State Oceanic Administration (No. 201305016), the project of Department of Ocean and Fisheries of Liaoning Province (No. 201805), and the Science and Technology
Innovation Fund Research Project (No. 2018J12SN079)]
作者简介: 吕孟冈，在读硕士研究生，研究方向：微生物。E-mail:************************通讯作者：苏鹏，博士，讲师，专业方向：细胞生物学。E-mail:**************
李庆伟，博士，教授，研究方向：细胞遗传学。E-mail:************
DOI: 10.20-332 网络出版时间: 2021/2/2 11:16:45
URI: knski/kcms/detail/20210201.1110.006.html
综 述
RHR 转录因子家族起源、功能以及进化机制的研究进展 吕孟冈1,2，刘艾嘉1,2，李庆伟1,2，苏鹏1,2
医用泡棉1. 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116081
2. 辽宁师范大学七鳃鳗研究中心，大连 116081
摘要: 转录因子是一类能够通过与基因特异性序列进行结合，从而调控基因转录与表达的蛋白质，对细胞的生物学 活性具有重要的调节作用。RHR (Rel-homology region, RHR)转录因子家族属于IF (immunoglobulin fold)转录因子超家族最主要的成员，其成员含有保守的Rel 结构域和IPT (immunoglobulin-like fold)结构域。作为古老的转录因子家族，RHR 家族成员随着物种演化，通过基因的复制、突变和沉默，不断分化出新型同源基因的同时也伴随着基因的丢失。自然选择导致了各家族成员不同的进化速率，并且在一些功能结构域上展现出了特殊的进化机制。然而，目前有关RHR 家族起源和分化的综述比较少见。本文综述了RHR 家族各成员的分布、分类、功能及家族进化等方面的研究成果，以期为研究整个转录因子家族的演化机制和物种之间的进化关系提供参考和新的思路。 关键词: 转录因子；RHR 家族；进化；基因复制；同源基因
Progress on the origin, function and evolutionary mechanism of RHR transcription factor family
Menggang Lv 1,2, Aijia Liu 1,2, Qingwei Li 1,2, Peng Su 1,2
1. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China
2. Lamprey Research Center, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China
Abstract: Transcription factors are a class of proteins that regulate gene transcription and expression by binding to
gene-specific sequences and play an essential role in regulating the biological activities of cells. The RHR (Rel-homology木粉
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region) transcription factor family is the primary member of the IF (immunoglobulin fold) transcription factor superfamily, whose members contain the conserved Rel domain and IPT (immunoglobulin-like fold) domain. As an ancient transcription factor family, the RHR family continues differentiation on gene gain and loss through gene duplication, mutation, and silencing, accompanied with the evolution of diverse species. Natural selection has led to different rates of evolution among members of the family, and some domains of the protein family have shown unique mechanisms of evolution.
However,
the current reviews about the origin and differentiation of RHR family are rare. In this review, we summarize the research results on the distribution, classification, function, and evolution of the members of the RHR family in order to provide a reference and new idea for studying the evolution mechanism of the whole transcription factor family and the evolutionary relationship among species.
Keywords:transcription factors; RHR family; evolution; gene duplication; homologous gene
转录因子(transcription factors, TFs)即反式作用
因子在基因转录过程中结合其顺式作用元件，参与
靶基因的转录调控，对细胞的免疫，分化和死亡起
着重要的调节作用[1]。转录因子一般包括两个主要
功能域，即DNA特定序列结合域(DNA binding do-
main, DBD)和转录激活结构域(transcriptional activa-
tion domain, TAD)。根据DNA结合域的最新分类，
将转录因子分为10个超家族，主要包含锌指结构域
(zinc finger domain, ZFD)超家族、螺旋–转角–螺旋
(helix-turn-helix domain, HTH)超家族、碱性结构域
(basic domain, BD)超家族和免疫球蛋白折叠(immu-
noglobulin fold, IF)超家族等[2]。其中对于转录因子
中ZFD超家族和HTH超家族的研究较为广泛[3]，但是有关IF超家族的综述类研究却比较少见。RHR (Rel-homology region)，也被称为RHD (Rel-homology domain，即Rel同源结构域)家族属于IF超家族最主要的成员，其都含有保守的Rel结构域和IPT (immu-noglobulin-like fold, IPT)结构域[2]。它们具有结合特异性DNA序列，形成二聚体和蛋白质结合等功能[4,5]。RHR家族主要包含NF-κB (nuclear factor-κB)、NFAT (nuclear factor of activated T-cells)、EBF (early B-cell factor)和RBP (recombination signal binding protein)等亚家族。它们在真核生物中分布十分广泛，并且随着物种由简单到复杂，分别进化出多种类型的旁系同源基因(图1)。本文以RHR家族为代表，总结了其4个亚家族成员的分类、功能、起源与进化机制，以期为IF转录因子超家族的演化研究提供参考。图1 RHR家
族蛋白的在12种真核生物中的分布情况Fig. 1 Distribution of RHR family proteins in 12 eukaryotes
根据已有文献和NCBI数据库中的数据对RHR转录因子家族蛋白绘制分布图。含有“0”、“1”、“2”蛋白个数，分别用亮灰、玫红和蓝表示。
1 古老的转录因子—NF-κB
NF-κB是一类在细胞基因诱导调控中起着广泛作用的转录因子，被Sen等[6]首次发现于B淋巴细胞提取物中，因其能与κ轻链基因附近的核因子特异性结合而得名。在哺乳动物中，NF-κB家族成员主要包括：RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κ
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点焊机电极>草坪卷
B1(p105)和NF-κB2(p100)[7]。该家族成员N端具有高度同源的Rel结构域[8]和IPT结构域，此外还具有核定位序
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列(nuclear localization sequence, NLS)。哺乳动物中NF-κB家族分为两类：第一类包括RelA(p65)、RelB 和c-Rel，没有前体，除了Rel结构域之外，C末端具有转录激活结构域(TAD)。第二类包括NF-κB1 (p105)和NF-κB2(p100)，其C末端区域含有ANK结构域(ankyrin repeat, ANK)[9]。ANK结构域是多个残基串联的基序，它们协同折叠成结构，通过蛋白质间相互作用来介导分子识别[10,11]。NF-κB家族成员可以形成同源二聚体或异源二聚体，并且它们通常也是以二聚体的形式发挥作用[12]。当细胞受到外界信号刺激后引发一系列反应，使IKK(inhibitor of kappa B kinase, IKK)活化。活化的IKK，诱导IκB (inhibitor of kappa B, IκB)蛋白快速降解。释放出NF-κB复合物，从细胞质转移到细胞核发挥调节转录作用[13]。
在进化过程中RelA、RelB和c-Rel具有一个高度保守的RFRYXCEG序列，能够识别DNA[14]。海葵(Nematostella vectensis)是已知的一种在该序列的关键位置具有Cys/Ser多态性的物种[15]。研究发现海葵中的等位基因Nv-NF-κB Cys与DNA的结合能力要高于Nv-NF-κB Ser。海葵的NF-κB这种多态性为研究NF-κB家族的Cys/Ser等位基因在自然界中是如何进化提供了可能[15]。此外，研究人员收集了
403只不同种的海葵，通过对Nv-NF-κB基因研究，鉴定出309个Cys/Cys纯合子，23个Ser/Ser纯合子和71个Cys/Ser杂合子，并计算出了遗传分化指数(F st)为0.56，这表明该多态性在各亚之间存在高度的分化[15]。研究还表明，Nv-NF-κB Ser对过氧化物和烷化剂等化合物具有更强的耐受性，这些化合物往往是在河口或者沼泽等地方含量较高，而在这种环境中分布了更多的Nv-NF-κB Ser型海葵。因此，这很可能是由环境因素导致了这两个类的分化，体现了受适应性辐射影响的特点，同时这也是一种自然选择的结果。通过对RelA、RelB、c-Rel家族基因的进化速率的分析，它们表现出了非常相似的进化速度，RelA、RelB、c-Rel分别在0.77、0.79和1.01 PAU，其中RelB的进化速率稍快[16]。此外，如上所述，NF-κB家族成员之间可以通过相互作用形成同源二聚体和异源二聚体：c-Rel、RelA/p65、RelB、p50/p105和p52/p100，共同调节目的基因的表达[17]，因此它们之间可能存在一种协同进化的关系[18]。研究表明，他们首次出现分化的证据是在果蝇(Dro-sophila melanogaster)中被鉴定出了Dif和Dorsal基因，果蝇的这两个基因在同一条染体的相邻位置，并且都具有Rel同源结构域和相似的基因结构，因此这两个基因很有可能是在进化过程中通过复制产生的[19]。Dif和Dorsal基因的产生，也伴随着新功能的获得，这体现在它们与另外一种家族成员Relish 在免疫信号通路的调节上存在着差异。当行使免疫调节功能时，Dorsal和Dif被Cactus磷酸化之后，才能进行基因表达调控，而Relish的活化需要Ird5 (immune response-deficient 5, Ird5)蛋白将其C端的ANK结构域进行切割，从而释放Relish入核[20]。随后，进化至硬骨鱼阶段出现了成熟的RelA、RelB、c-Rel 的基因分型[21]。在哺乳动物中，与RelA和c-Rel不同的是，RelB发挥激活转录调控功能还需要LZ
(leucine zipper, LZ)结构的参与[22]，这个结构域对于RelB与DNA序列的结合和蛋白质的相互作用是不可或缺的，而RelA和c-Rel并不具备这样的辅助结构域[23]。然而，有关于RelB中的LZ结构起源和演化的分子机制尚没有明确的报道。值得一提的是，NF-κB家族基因和MyD88 (myeloid differentiation pri-mary response 88)基因在线虫(Caenorhabditis elegans)基因组中是缺失的，这提示线虫可能是通过其他转录因子和信号转导途径来行使免疫应答的[24,25]。哺乳动物的NF-κB家族中另外的两个成员NF-κB1和NF-κB2在C末端含有具有抑制性作用的ANK结构域。由于早在细菌中就发现了仅含有ANK结构域的蛋白(简称ANK蛋白)[26]，表明脊椎动物NF-κB1和NF-κB2的进化是逐渐演变而来的。原始仅含有Rel 结构域蛋白的NF-κB (简称Rel蛋白)和更为古老的ANK蛋白在NF-κB家族蛋白进化早期有可能发生了特异性的相互作用。这导致在单细胞原生动物中产生了极为简单的Rel-ANK融合型NF-κB蛋白[27]。随后，研究发现海葵形成了Rel蛋白和IκB蛋白，这可能是基因裂解或丢失C-末端ANK结构域的结果[28]。然而，目前还没有足够的序列信息来确定Rel 蛋白的真正起源。
2 NFAT的起源与家族成员的分化
NFAT(nuclear factor of activated T cells)蛋白首
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次在T细胞中被发现[29,30]。NFAT家族有5位成员分别为NFAT1(NFATc2或NFATp)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)和NFAT5[31]。NFAT家族蛋白包含两个TAD结构域，一个调节结构域(NFAT homology region，NHR)，一个高度保守的Rel结构域和一个羧基末端结构域[32]。NFAT家族分为两类，分别为经典家族和非经典家族。NFAT蛋白的经典的家族成员包括：NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4，具有钙调蛋白结合位点，受Ca2+和钙调蛋白的调控[33,34]。大量研究表明，钙调神经磷酸酶与经典的NFAT蛋白结合并使其脱磷酸化，从而诱导其进入细胞核并发挥转录活性，非经典家族成员仅包括NFAT5，其并不需要钙调神经磷酸酶参与其活性[35]。NFAT5可以形成同源二聚体，其同源二聚对与DNA结合和转录活性至关重要[36]。
通过物种之间的NFAT基因同源性分析显示，在单细胞真核生物如酿酒酵母(Saccharomyces cere-visiae)，短毛啤酒酵母(Saccharomyces brevis)和海绵(Amphimedon queenslandica)生物的基因组中未能发现NFAT的同源基因，而是在海葵基因组中存在一个与人NFAT5相似的NFAT基因[37]，不过在线虫基因组中发生了缺失。在进化过程中，NFAT家族经过了多次基因的复制和功能的分化，在无脊椎动物和脊索动物(玻璃海鞘Ciona intestinalis，文昌鱼Branchiostoma floridae)基因组中只含有一个NFAT 同源基因，从无颌类脊椎动物的海七鳃鳗(Petro-myzon marinu)开始，逐渐出现了更多的分化。随后在象鲨(Callorhinchus milii)的基因组中发现了4个旁系同源基因[38]。从鱼类如青鳉(Oryzias latipes)、斑马鱼(Danio rerio)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)等开
始[39~43]，再到非洲爪蟾(Xenopus laevis)和哺乳动物(大家鼠Rattus norvegicus，家鼠Mus musculus)基因组中出现了5个完整的NFAT家族基因分型[44~47]。因此，海葵中的类NFAT5基因有可能是该家族的最原始成员。此外，Graef等[48]和Gauthier等[11]的研究显示，因为NFAT和NF-κB都含有Rel同源结构域，并在硬骨鱼NFAT的基因结构中发生了易位外显子和Rel结构域编码基因的重组，因此它们可能含有共同的祖先基因。然而，在线虫中NFAT和NF-κB都有所缺失，并且NFAT3在鸟类如原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)的基因组中也发生了丢失，而NFAT和NF-κB还表现出基因组结构多样化和功能分化的特征，因此NFAT和NF-κB的协同进化关系还需要进一步的确认[49,50]。为了研究NFAT家族基因的演化动力学特点，研究人员对这些基因构建了系统发育树。结果显示NFAT家族基因被分为3个类：NFAT1(包含NFAT1和NFAT2)、NFAT4(包含NFAT3和NFAT4)和NFAT5，NFAT1和NFAT4仅存在于脊椎动物中。由此判断，在脊索动物出现之前，至少发生了一次基因复制，这次复制导致了NFAT5类和NFAT1-4类这个两个分的产生。这次复制也使得NFAT5和NFAT1-4在结构域上产生了不同，经典的NFAT形成了钙调磷酸酶结合域，这个结构域调节它的入核，而NFAT5的核穿梭是由核输出序列(nuclear export sequence, NES)、核输出结构域(auxiliary export domain, AED)和核定位信号(NLS)共同介导的，这表示NFAT5和NFAT1-4功能上产生了差异[51]。PAML选择压力分析表明，许多NFAT家族基因分支显示了强烈的正向选择，在基因复制时加速了原始NFAT基因序列的突变，从而产生了新的分型[42]。因此，再结合全基因组复制(whole genome duplication，WGD)理论表明，完整的NFAT家族基因很有可能经历3轮全基因组复制事件[52,53]。首
先，在第一次复制时产生了类NFAT5和类NFAT；随着第二次复制，类NFAT 分化产生NFAT1和NFAT4；最后一次复制，NFAT1分化成了NFAT1和NFAT2，而NFAT4分化成了NFAT3和NFAT4[42]。
3 EBF的特殊结构与演化
EBF (early B-cell factor)转录因子家族，也被称为COE (collier (col) and olfactory-1/early-B-cell factor)转录因子，早期从果蝇和小鼠体内分离[54~56]，具有指导多种神经元组织细胞分化的功能。哺乳动物中EBF家族成员包括EBF1、EBF2、EBF3和EBF4。在哺乳动物中EBF转录因子家族成员含有DBD结构域，IPT结构域、非经典HLH(helix-loop-helix)结构域和TAD结构域，这些结构域在进化上具有保守性[57]。其中在DBD结构域中，含有一个非典型的锌指(H-X3-C-X2-C-X5-C)基序，并且对于DNA结合起
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重要作用[57,58]。IPT可能通过同源二聚或异同源二聚作用参与EBF家族与其他蛋白质的结合[57]。此外，EBF家族的非经典HLH结构域，是由三个α-螺旋(H1-H2d-H2a)组成，其结构域在H1和H2之间的loop环中存在一个PXXPXXP基序，该基序在蛋白结合方面扮演重要角[59]。
目前尚未发现EBF基因存在于真菌、植物或任何一个原生动物中。研究表明在无脊椎动物中，如海葵
、线虫、果蝇、海鞘和文昌鱼中均发现了单一的EBF同源基因[55,60~63]。其中，通过对尾索动物和头索动物的EBF序列分析发现，这很有可能是脊椎动物EBF的祖先。而随着物种进化，在最原始的脊椎动物七鳃鳗中出现了EBF的同源基因的分型，分别将其命名为COE-A和COE-B，这两个同源基因在HLH结构域的核苷酸序列之间存在剪切差异[64]。进化至硬骨鱼阶段，在斑马鱼和蟾蜍(Xenopus laevis)中都分化出了3个类型的EBF家族基因[65,66]。直到高等脊椎动物人和小鼠中，出现成熟的4个EBF旁系同源基因。而各物种中EBF基因的功能在某些方面也是存在差异性的，其中果蝇和线虫中EBF转录因子能够调节肽能神经元的发育，爪蟾和鸡的胚胎中的EBF转录因子具有促进神经元分化的功能，小鼠体内EBF转录因子在神经系统发育方面也扮演着不同的角，EBF1对于面部肌肉迁移以及纹状体和视网膜神经元分化起着的关键作用，而EBF2则侧重于对小脑和嗅觉上皮神经元细胞的迁移和分化[67]。EBF转录因子DBD结构域中的锌指基序是一种非典型的基序，其所含有的H157、C161、C164和C170可以形成稳定的loop(H-X3-C-X2-C-X5-C)结构，与经典的锌指结构类似，具有识别DNA序列以及形成二聚体的作用[57]。晶体学结构分析显示，尽管EBF的DBD结构域与NF-κB和NFAT家族蛋白的Rel结构域的序列同源性不高，但是它们在三级结构上面却有着一定的相似性[59]。而不同之处在于，EBF的DBD结构域在空间上形成了不一样排列的β片层以及其独特的“伪Ig-like”折叠(即IPT结构域)[68]。除此之外，不像NF-κB和NFAT、EBF的DBD结构域并不与DNA结合，而是通过IPT结构域参与DNA的结合、形成二聚体和蛋白质-蛋白质的相互作用[69]。因此，EBF虽然在序列上存在差异，但是为了适应结合DNA等功能，从而完成基因的转录调控，在空间结构的折叠上面表现出了趋同进化的dna测序
特点[68]。哺乳动物的EBF蛋白质中存在的3个α-螺旋重复序列(H1、H2d和H2a)，其中每个序列都由单独的外显子(外显子E11、E12和E13，分别由内含子i11和i12分隔)编码[57]。通过分析了脊索动物之外的物种如玻璃海鞘、文昌鱼和紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)等H1和H2a外显子序列，都证明它们的基因中不存在与H2d相关的编码序列。相反，通过对有颌类基因组序列分析发现，包括EBF1-3或EBF1-4，都发生了H2a-H2d的复制。值得一提的是七鳃鳗COE-B 蛋白含有H2d α-螺旋，而COE-A蛋白却没有，因此结合上述研究表明，H2a-H2d的复制在进化上非常有可能早于有颌类脊椎动物[64]。脊椎动物EBF蛋白中的H2d和H2a序列比对显示，H2a-H2d并不是由外显子E12和E13简单复制所产生的。因此，研究人员对此提出了“two-step”进化模型的假设，认为H2d的产生机制有可能是通过两步完成的(图2)。首先，脊椎动物祖先外显子E13复制之后，通过选择性剪切整合到mRNA中，形成过渡性序列。由于E13复制后的插入序列导致E12外显子下游内含子相位发生改变，这样便影响了下游序列的翻译，因此序列又经过一次剪切，使E12和E13之间的内含子恢复0相位，形成“对称”的外显子(E11-E12-E13)，从而顺利完成H1、H2d和H2a 的编码[70]。
4 RBP家族蛋白的起源与进化
RBP (recombination signal binding protein)家族蛋白对于神经系统的发育和造血系统的分化具有至关重要的作用[71]，并且对于神经细胞分化的作用在生物进化过程中是保守的[72~75]。后生动物RBP蛋白有两种亚型，一种是RBP-Jκ (recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J regi
on)，其在Notch信号通路中发挥重要作用；另一种是RBP-L (recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region like)，其功能并不依赖于Notch信号通路[76]。RBP蛋白由3个结构域组成：N端结构域(N-terminal domain, NTD)、β折叠结构域(β-trefoil domain, BTD)和C端结构域(C-terminal domain, CTD)[77]。经过对其序列分析和结构研究证
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